3乙酰化是生物体内经常进行的生化反应之一，乙酰转移酶对乙酰化反应的催化作用尤为重要。10315和21790基因在沙雷氏菌FS14中被注释为乙酰基转移酶，为明确它们的功能，以沙雷氏菌FS14的总DNA为模板，PCR扩增出10315基因和21790基因，并将其连接到pCold-xmx-2质粒上，在沙雷氏菌(Serratia sp.)FS14中进行过表达。含重组质粒10315的菌株经诱导后表达出约25 kDa的蛋白，21790的菌株表达出约25 kDa的蛋白。这两种蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化，再通过凝胶过滤层析获得了纯度较高的重组蛋白，但蛋白量较少。将表达量较高的10315重组质粒转入大肠杆菌E. coli C43（DE3）表达，获得了表达量更多，纯度更高的蛋白，随后进行了初步的结晶条件筛选。
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引言
引言
沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，是一种在水和土壤等环境中广泛存在的兼性厌氧菌，能产生紫色、黄色和红色非水溶性色素，是一种革兰氏阴性菌。在生物体中一般存在于动物的肠道或呼吸道中，或在植物的茎、叶等器官上[1]。粘质沙雷氏菌能分泌红色的灵菌红素，灵菌红素体现多种生物活性，如抗菌，抗霉，免疫抑制等[2]。
本课题研究的是沙雷氏菌中的两种酰基转移酶（10315）和（21790），它们都属于N乙酰基转移酶( Nacetyltransferase , NAT )。
在细菌中，N乙酰转移酶能影响细菌的毒力。乙酰转移酶能通过调控双组份系统影响细菌的毒力。双组份系统（TCSs , TwoComponent Systems）是细菌中被广泛研究的信号转导系统，它将外部的不利环境条件，翻译成化学信号并传递至胞内，让细菌能及时调整自身状态以适应逆境[3]。
细菌的耐药性也与N乙酰基转移酶的活性有关。随抗菌药物在临床上的普及，不同程度的耐药性在一些细菌中体现出来，并且其耐药性还在逐渐加深[4]。现今，有多种产生抗药性的原因，包括细胞膜通透性的降低、细胞主动外排药物、作用靶点的改变等。细菌内部有多种修饰酶，其中包括N乙酰基转移酶。类似的修饰酶对氨基糖苷类抗生素的氨基和羟基进行修饰，抑制抗生素到结合位点，使细菌出现耐药性[5]。这是细菌产生耐药现象的原因之一[6]，对N乙 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
酰基转移酶结构研究能针对性的分析靶点，可以进一步了解耐药性。
生命科学在微观水平的探索从未止步，人们开始熟知各种生命现象。而酰基转移酶的酰基化作用在生命现象中的重要性也必将更为人们所重视[7]。本实验采用分子生物学技术，将沙雷氏菌FS14中的乙酰基转移酶（10315和21790）的目的基因用PCR技术扩增，将目的片段酶连进表达载体，转入粘质沙雷氏菌FS14和大肠杆菌C43中进行表达，将表达产物进行纯化，得到有活性的目的蛋白，再进行初步的结晶条件筛选。为乙酰转移酶的晶体学研究打下了基础。
1材料与方法
材料
1.1.1菌株及质粒
表达宿主E. coli C43 (DE3) 由本实验室保存；表达宿主Serratia marcescens FS14由本实验室分离，鉴定和保存；克隆宿主E. coli DH5α由本实验室保存；表达用重组质粒pColdxmx2由本实验室构建并保存。
1.1.2试剂与仪器
A. LB培养基：
胰蛋白胨10 g / L，酵母提取物5 g / L，氯化钠10 g / L，培养基根据需要在冷却后加入100 μg / mL 的卡那霉素。
固体LB培养基另加入琼脂粉，按质量体积比加入1.5 %的琼脂粉
培养基根据需要在冷却后加入100 μg / mL 卡那霉素
实验中的常规试剂：
常用酸碱（盐酸、醋酸、氢氧化钠）、EDTA、丝蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），蛋白诱导剂异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（IPTG），卡那霉素（KAN），琼脂糖，琼脂粉，胰蛋白胨，酵母提取物，常用无机盐（磷酸盐，醋酸盐等），常见缓冲液（TAE、TBE、Tris甘氨酸、TrisHCl），DNA核酸标准分子量，蛋白标准分子量等。
分子克隆所用的酶：
Pfu DNA polymerase，T4 Ligase，限制性内切酶（TaKaRa）：Xho I和Nde I
实验仪器：
分光光度计；稳压稳流电泳仪；移液枪；常温离心机和低温离心机；立式高压蒸汽灭菌锅；恒温培养箱；超净台；恒温水箱电热恒温水浴锅；紫外凝胶成像仪；PCR扩增仪。
1.2实验方法
1.2.1目的蛋白基因的克隆
1.2.1.1 引物设计与合成
根据NCBI上沙雷氏菌(Serratia sp.)的基因组信息，确定蛋白10315和21790的编码序列，设计上下游引物（上游引物引入Nde I酶切位点；下游引物引入Xho I酶切位点，用下划线标出酶切位点）引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。
10315 上游引物：5ˊATGCCATATGTCCACCTTGCTTACCCTC 3ˊ
下游引物：5ˊACCCTCGAGATCGCCGTGGCGTTCG 3ˊ
21790 上游引物：5ˊATCGCATATGATCCCGGCCATCCGC 3ˊ
下游引物：5ˊATCGCTCGAGGTAACCGATTTCGCTATTGAAC 3ˊ
1.2.1.2 目的片段扩增
用ddH2O将引物稀释到工作浓度为20 μM。以沙雷氏菌FS14总DNA为模板，用PCR扩增来获得目的基因片段10315和21790。
1.PCR反应体系为50 μL：
Template：1 μL
dNTP( 2.5 mM )：4 μL
10× pfu Buffer：5 μL
PrimerF：4 μL
PrimerR：4 μL
DMSO：2.5 μL
Pfu enzyme：0.5 μL
ddH2O： 29 μL
2.PCR反应程序：
94 ℃5 min
94 ℃30 s
58 ℃30 s
72 ℃1 min

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563649.html