转录因子OsTGAx是bZip家族的一个成员，其生理功能尚无明确报道。叶夹角的大小直接影响水稻叶面积指数，从而调控光合作用。本研究前期获得了OsTGAx的T-DNA插入纯合突变体ostgax，发现ostgax的叶夹角显著小于野生型，并且ostgax中，油菜素甾醇信号通路上的关键基因OsILI1的表达水平明显低于野生型。在此基础上，本研究进一步发现，避光-条件下，外源2,4-eBL处理显著增大野生型的离体叶夹角，但是对OsTGAx和CRISPR突变体两个株系的离体叶夹角则无显著影响；另外， 外源2,4-eBL直接处理水稻幼苗也产生类似的效应。本研究还发现OsTGAx过表达材料的叶夹角显著大于野生型。利用酵母表达系统证实OsTGAx具有的转录激活活性；酵母单杂交和染色质免疫共沉淀实验证明OsTGAx可以与OsILI1的启动子区结合。此外，本研究还发现OsTGAx在烟草叶片中表达能够明显增强OsILI1启动子驱动的Gus报告基因的表达。综上所述，本研究初步证实了OsTGAx可直接结合OsILI1的启动子，并激活OsILI1基因的表达，从而调控BR信号转导。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 过表达材料及CRISPR材料鉴定 3
1.2.2 外施2,4eBL后野生型水稻DJ、CRISPR材料及过表达材料表型3
1.2.3 染色质免疫共沉淀3
1.2.4 酵母单杂交5
1.2.5 瞬时双荧光素酶表达测定5
2 结果与分析5
2.1 2，4eBL处理对不同基因型水稻叶夹角的影响5
2.2 2，4eBL处理后野生型DJ和过表达材料表型比较 7
2.3 OsTGAx 转录活性测定7
2.4 OsTGAx 能够与OsILI1基因启动子结合8
2.5 OsTGAx在烟草叶肉细胞中激活OsILI1基因的表达 9
3 讨论 10
致谢 10
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参考文献 11
转录因子OsTGAx对OsILI1基因转录调控的初步研究
引言
水稻是重要的粮食作物，与人类生活息息相关，国内关于水稻的研究水平也较为领先。实践证明，水稻的产量不仅受其生长环境的影响，也与其株型有关。其中，叶夹角的大小直接影响水稻叶面积指数, 进而调控群体光合作用, 是水稻株型育种中重要的指标。因此，研究其发育机制对水稻株型育种具有重要的意义。
油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一类多羟基化甾醇类化合物，有着“第六种植物激素”之称。[1,2]其主要的生理作用包括调节植物器官的生长，分生组织的分化，种子的萌发，维持植物顶端优势，并且和植物光合作用有关。在水稻中，BRs主要调控植株大小、植株分蘖、叶夹角等诸多影响水稻产量的农艺性状。[3]近几年通过研究拟南芥BR信号分子在水稻中的同源基因以及水稻BR敏感突变体鉴定，也使得使水稻BR信号研究有了突破性进展[4]，发现BR可通过诱导近轴面细胞伸长导致叶夹角增大。目前已证明OsBRI1[5]、OsBUI1[6]、OsBZRl[7]、OsILI1[8]等参与BR信号转导,但就目前已知的BR信号转导组分尚不能构成一个完整的信号转导过程，以及它们影响水稻形状的机制也还不明确，所以这方面的研究有待进一步突破。
转录因子，又称反式作用因子，是可以与靶基因上游的顺式作用元件相结合，从而对靶基因的表达起促进或抑制作用的DNA结合蛋白。[9]转录因子存在于全部的真核生物中，在真核生物生长过程中起重要作用。TGA（TGACG motifbinding factor）转录因子，属于bZIP（basic leucine zipper，bZIP)家族的D亚组，它能够与以TGACG为核心的激活序列（activation sequence 1，as1）特异性结合，调节基因的转录水平。[10]TGA转录因子在植物抗逆性以及花的器官发育中发挥至关重要的作用，是基因工程改良作物和林木的重要遗传靶标。但现在对于TGA转录因子的研究较为有限，主要集中在以模式生物拟南芥为材料的研究中，对于水稻等其他植物的材料研究较少。
因此，研究水稻中转录因子OsTGAx对BR信号转导途径的完善具有重要意义。本研究前期获得了OsTGAx的TDNA插入纯合突变体ostgax，发现突变体的叶夹角显著小于野生型。并且在突变体中，油菜素甾醇信号通路上的关键基因OsILI1的表达水平明显低于野生型。但是转录因子OsTGAx是否直接调节OsILI1的表达尚不清楚。本研究将通过植物生理学和分子生物学研究方法，通过过表达材料以及CRISPR材料，进一步确定OsTGAx在油菜素内酯信号转导中的作用，并初步确定OsTGAx是否直接调控OsILI1转录。
材料与方法
材料
1.1.1材料
水稻种子（野生型材料（产出地东津）；突变体ostgax；CRISPR材料NF1006、NF1074；过表达材料OE11、OE12）
1.1.2试剂
质粒小量提取试剂盒；PCR产物纯化试剂盒；2，4eBL；甲醛；甘氨酸；NaCl等
1.1.3载体
pGBKT7；pCambia1307；pGreen；pGADT7
1.1.4菌株
MaV203酵母菌株
1.1.5培养基
LB培养基
AbA选择培养基
1.2方法
1.2.1过表达材料及CRISPR材料繁种与鉴定
CRISPR材料繁种：
提取CRISPR植物材料的基因组DNA进行扩增；并以野生型DJ的水稻材料的基因组DNA为对照；
将扩增出来的序列送公司测序,比对测序结果以选取突变的植株繁种。
过表达材料繁种：
提取过表达材料的RNA，并以野生型DJ的RNA作为对照，利用特异的QPCR引物进行荧光定量PCR；
选取基因表达量上调的株系繁种。
1.2.2外施2,4eBL后野生型水稻DJ、CRISPR材料及过表达材料表型
将野生型水稻DJ、Crisper材料及过表达材料的种子置于水中浸泡34天，将已萌发的种子播进96孔板，用去离子水培养7天后去胚乳；
每隔3天更换一次水稻营养液(培养条件：26°C光培养14 d，2000Lux)待水稻幼苗长至2叶1心(约1416天龄)；
对野生型DJ、ostgax、CRISPR及过表达材料的幼苗进行外施2，4eBL处理(外施2，4eBL是将2，4eBL加入到营养液中)，观察各株系水稻苗的叶夹角的差异。与此同时选取生长状况相近的水稻幼苗，将叶倾角剪下，进行离体培养，并比较。

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