AMPK，全称为Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase。其为AMP依赖型蛋白激酶，在细胞中扮演能量状态传感器角色，是生物体内的能量调控开关，通过微调合成代谢和分解代谢途径来维持能量储存。而SNFl／AMPK通道相关研究主要集中在酵母领域，较少涉及丝状真菌，特别是在食用真菌领域，此通道的研究相对更少。因此本实验首先克隆金针菇AMPK基因，然后通过构建金针菇AMPK沉默菌株，初步探究AMPK在金针菇中的功能以及AMPK对金针菇氨基酸代谢的影响。克隆得到的AMPK基因为2034 bp, 筛选到了AMPK沉默效率在42.12%的菌株AMPKi-3和沉默效率在43.58%的菌株AMPKi-9。测定得到AMPKi-3菌株和AMPKi-9菌株精氨酸含量分别是21.63 mg/g DW和21.54 mg/g DW，赖氨酸含量分别是29.89 mg/g DW和29.25 mg/g DW，与野生型无显著差异，说明沉默AMPK对于金针菇精氨酸和赖氨酸含量无影响。对沉默菌株进行进一步柠檬酸处理后，AMPK基因沉默菌株中柠檬酸诱导赖氨酸生物合成的现象消失。这拓宽我们对于AMPK 在金针菇中功能的认识，进一步研究提高金针菇的产量和品质的方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言（或绪论）1
1材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1．1实验菌株 3
1.1.2培养基的配制 3
1.1.3主要实验仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1金针菇AMPK基因的克隆3
1.2.1.1 金针菇总RNA的提取和cDNA的制备3
1.2.1.2 设计引物 4
1.2.1.3 PCR扩增目的片段4
1.2.1.4 PCR产物回收5
1.2.1.5 PCR产物TA连接5
1.2.1.6大肠杆菌DH5α感受态细胞制备5
1.2.1.7 转化 6
1.2.1.8 碱裂法提取质粒 7
1.2.1.9 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
酶切与回收 7
1.2.1.10沉默基因与沉默载体酶连 8
1.2.1.11转化与测序 8
1.2.1.12分装保存菌液与质粒 8
1.2.2金针菇AMPK沉默菌株的构建 8
1.2.2.1金针菇原生质体制备、脂质体转化 8
1.2.2.2 RNA提取 9
1.2.2.3荧光定量PCR验证沉默转化子的沉默效率 9
1.2.3 金针菇AMPK沉默菌株赖氨酸、精氨酸含量测定10
1.2.3.1 种子的培养10
1.2.3.2 液体种子的制备10
1.2.3.3 二次摇瓶发酵10
1.2.3.4精氨酸测定方法坂口试剂法 10
1.2.3.5 赖氨酸测定方法茚三酮法 10
1.2.3.6 统计分析法11
2结果与分析11
2.1金针菇AMPK基因克隆 11
2.2金针菇AMPK沉默片段的获取 12
2．2．1 AMPK基因片段经过PCR扩增和TA连接转化后结果12
2．2．2 酶切结果 12
2．2．3 酶切成功的基因片段和沉默载体酶连后，转化验证结果 13
2．2．4 酶连成功后测序结果 13
2.3金针菇AMPK基因沉默菌株构建 14
2.4 AMPK沉默菌株赖氨酸、精氨酸含量的变化 14
2.5 AMPK沉默菌株在柠檬酸最佳诱导下菌丝生长及赖氨酸含量的变化 15
讨论 15
致谢 16
参考文献 16
附录 18
金针菇AMPK基因的克隆、沉默菌株构建及功能研究
引言
引言
金针菇(Flammulina velutipes (Curt．ex Fr) Sing.)，又称冬菇、智力菇、毛柄金钱菌等[1]。作为一种传统的食用菌品种，金针菇已在世界上形成大规模的现代化工厂种植，其中中国的年产量已经达到世界第一[2]。由于金针菇含有高于其他菇类的非常丰富的氨基酸，以及火菇素、火菇毒素、糖蛋白、多糖、蛋白聚精、倍半萜等多种生物活性物质[3]， 而被广泛认为具有很高的药用价值，在国际市场上还享有“超级保健品”的荣誉[4]。我国传统医学认为，如果摄入金针菇，就有提高智力以及抗肿瘤的功效。而金针菇中丰富的赖氨酸，能促进孩童的生长发育，能增强记忆力，提高智力；精氨酸能预防和医治胃、肠道急症等消化系统疾病[5]。
AMPK包含在Ser / Thr（丝氨酸/苏氨酸）蛋白激酶类型中，其在真核细胞中大量存在。这几年，诸多实验结果显示，AMPK对细胞能量代谢具备调控作用，具体作用机制主要为，调控能量物质合成、氧化，同时改变转录关键酶活性 [5]。若ATP在细胞中含量下降，AMPK能够对胆固醇、脂肪、碳源的合成施以抑制，从而实现减弱其利用目的；此外，AMPK同时能够对葡萄糖转运、脂肪酸氧化加以促进，从而实现增强其产生目的 [6]。故而，在细胞能量代谢调控方面，视AMPK为“开关”，也存在“细胞能量调节器”这一称谓。Carlson等[7]于1981年首先在酿酒酵母中发现了Snf1蛋白激酶。这些研究者首次分离得到一类突变株，其无法发酵且无法利用蔗糖，之后，对此突变株展开深入探究中，赋予其正式名称 sucrose non fermenting1（ SNF1）。在来源上，酿酒酵母所含 Snf1蛋白激酶和哺乳动物所含 AMPK一致，此蛋白激酶在能量代谢调控方面发挥着关键作用，在极大程度上有助于酿酒酵母的碳源利用[8]。
AMPK为异源三聚体，构成亚基包括α、β与γ，其中第1个亚基具备催化作用，后两类则具备调节功能[9]，在基因型构成方面，各亚基有所差别，其中亚基α存在α1、α2这2个基因型，β则存在β1、β2这两个基因型，γ基因型有γ1、γ2与γ3。各亚基间12类组建为复杂复合体[10]。在三个亚基中，α存在于催化核心区域（在N末端）和β，γ亚基结合区域（在C末端）;β具有两个保守区域，α，γ亚基结合区域和糖原结合区域。γ存在串行的4 个重复 CBS 区，此区受AMPK相连AMP影响[11]。在AMPK的情况下，组织分布中的三个亚基存在差异，α主要是肝脏，骨骼肌，肾脏，心脏和脑;β以骨骼肌、肝脏为主；γ可见于大部分组织内[12]。在酿酒酵母内，SNF1也属于源三聚体蛋白激酶，且也由α、β与γ这3个亚基构成，其中，α亚基由Snf1编码；β编码因子为Sipl、Sip2、Gal8；γ编码蛋白为Snf4 [13]。α亚基内分布激活区（于N端临近）、调控区（处在C端）；β亚基内存在保守的C端序列，此部分在和SNF1复合物互作发生方面起介导作用；γ亚基可以与SNF1因子和β亚基结合，且不依赖于葡萄糖。

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