土壤中存在大量的有益微生物。本研究以生物防治切花菊枯萎病为目的，从健康的菊花根际土壤分离有益菌，采用形态学和基因测序结合的方法，鉴定出该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。进一步探究了该菌株在不同培养条件下的生长情况，最后分别在平板和盆栽上进行试验，探究其对菊花枯萎病的病原菌—尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的防控效果，结果该菌株表现出了对枯萎病具有一定的防治效果。这为研究菊花枯萎病的生物防治提了供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 供试材料 2
1．2 试验方法 3
2 结果与分析 5
2．1 拮抗菌KC的形态观察及16srRNA序列的扩增与分析 5
2．2 不同培养条件对拮抗菌KC生长的影响 6
2．3 拮抗菌KC对菊花枯萎病的防控效果 7
3 结论与讨论 8
致谢 9
参考文献 10
枯草芽孢杆菌对菊花枯萎病防控效果的研究
引言
引言
菊花(Chrysanthemum morifolium)不仅是我国传统名花之一，也是世界四大切花之一，具有很高的观赏和商业价值。切花菊以设施连作为主，由于长期连作导致其枯萎病发生越来越严重。菊花枯萎病是一种常见的土传病害，又称菊花萎蔫病。在发病初期植株地上部叶片失绿、叶色变浅，失去光泽，一般不易察觉。接着叶片自下而上很快萎蔫下垂、黄化，这时观察茎秆会发现茎基部微肿变褐，表皮变成粗糙，间隙出现裂痕，发生严重时缝中甚至会出生白色霉状物，如果将病茎横切或纵切，会发现其维管束变褐，根部被病原菌感染后，也会变黑腐烂，根毛脱落，这样就导致植株很快萎蔫枯死[1]。由尖孢镰刀菌引起的菊花枯萎病在我国各地均有发生，防治困难，危害大，植株一旦染病，迅速萎蔫枯死，而且会给农业生产带来严重的经济损失。
尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是枯萎病的主要致病菌，是一种全球性分布的土传病原真菌[2]，该病原菌具有广 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
泛的宿主和对恶劣环境抵抗能力强的特点，目前，已经报道的被该病原菌感染，引起植物维管束萎蔫病、枯萎病的作物超过100种，包括香蕉、辣椒、黄瓜、草莓、番茄、甘蔗、棉花以及瓜类和豆科类等多种植物。被病原菌感染的植株，很快就会出现病症，而且疫病会在短短的几年内大面积发生，因此研究能够抑制该病原菌的生物药剂迫在眉睫。
目前枯萎病防治主要以化学防治和物理防治为主，即依赖化学药剂和抗病育种、轮作换茬等方法，但如果长期化学药剂，病原菌会产生抗药性，使得不得不增加药剂施用量来增加抗病效果，这样导致污染环境，危害人类等不断的恶性循环，另一方面由于土地资源的有限，轮作的方法也不易使用等受很多条件的限制，这些防治方法必将会成为防治植物病害的辅助手段，将会被生物药剂代替。近年来，已经筛选出大量的有益微生物来抑制枯萎病，用于防治枯萎病的微生物主要有真菌、细菌和放线菌[3]。枯草芽孢杆菌是防治枯萎病的有益微生物之一。
芽孢杆菌用于防治枯萎病害的例子在国内外有很多，也有很多的研究表明芽孢杆菌不仅具有防病作用，还对作物具有促生作用，对许多土传病害的都有明显的防治效果，还对其它十余种植物病原真菌有明显的抑制作用，显示了良好的应用前景。在国外，美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，分别是GB03、MBI600、QST713和B.subtilis var. amyloliquefaciens FZB24，其中GB03、MBI600和FZB24都可用于防治尖孢镰刀菌引起的枯萎病[4]。另外，枯草芽孢杆菌在俄罗斯也已经被开发利用，全俄植保所研究出了一种剂型为可湿性粉剂的枯草芽孢杆菌制剂，该药剂在田间表现出了较强的防治效果，可用于防治多种作物真菌病害，而且进一步证实该药剂具有增产效果。该公司还开发出一种对番茄细菌病害有防治作用的药剂Gamair，该产品也是枯草芽孢杆菌[13]。
在国内，李春雨研究发现芽孢杆菌SQRT3在NA培养基上对番茄青枯病病原菌有很强的拮抗效果[6]。有研究发现枯草芽孢杆菌菌液处理百合幼苗，能有抑制病原菌菌丝的生长，且枯萎病发病抑制率达到65.5%，抑菌作用随着枯草芽孢杆菌菌液体积分数的增加而增强。并且表现出对百合具有一定的促生作用[7]。还有研究指出，枯草芽孢杆不仅能有效防治由建孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病，还具有持效期长、防效下降慢的优点[9]。
枯草芽孢杆菌在其他作物的枯萎病防控效果的研究及应用已经有了很大的成就，但在菊花枯萎病上的研究很少，而且目前菊花枯萎病的防治大部分是以化学药剂为主，由于菊花枯萎病是土传性病害，化学药剂防控效果不大。因此，研究芽孢杆菌对菊花枯萎病的防控效果以及防控机理对菊花枯萎病的生物防治提供理论依据，而且也符合我国现代绿色发展理念。
1 材料与方法
1．1 供试材料
1．1．1 供试菌株
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：从大学湖熟菊花实验基地健康的切花菊‘神马’植株分离所得。
菊花枯萎病病原菌（Fusarium oxysporumB2）：由大学菊花实验室提供。
1．1．2 主要试剂和仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、灭菌锅、摇床、电子分析天平、可见分光光度计、恒温培养箱、光学显微镜、离心机、移液枪、超低温冰柜、电泳仪等。
1．1．3 培养基
LB液体培养基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl10.0 g、去离子水1000 ml，pH 7.27.4，121℃灭菌30 min。
LB固体培养基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl10.0 g、琼脂粉10.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.27.4，121℃灭菌30 min。
NA培养基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、牛肉膏3.0 g、酵母粉0.5g、琼脂15 g、去离子水1000 ml，pH 7.27.4，121℃灭菌30 min。

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