microRNA（miRNA）是一类在多细胞生物体内广泛表达的小分子非编码RNA，约22核苷酸（nt）大小。在动物细胞中，miRNA生物发生的细胞核过程的一个关键步骤即生物大分子Drosha与miRNA初级转录本（pri-miRNA）结合并切割产生前体miRNA（pre-miRNA），在之后的细胞质加工过程中，另一生物大分子Dicer将对pre-miRNA进行进一步的切割以产生双链RNA。已有的研究的表明，Drosha对其底物的识别、结合及切割活动均与它的双链RNA结合域（double-stranded RNA-binding domain，RBD）相关，与已知的其他RNA结合蛋白的RBD相比，人源及部分果蝇源Drosha的RBD另有一个包含了6个氨基酸的插入序列，有证据表明，该插入序列与Drosha结合、切割pri-miRNA的能力息息相关。通过将该Drosha插入序列的突变引入Dicer中，发现该突变会在一定程度上抑制Dicer切割及结合pre-miRNA的能力，并对miRNA的加工具有一定不利影响，推测该插入序列可能具有特异性。综上所述，该研究为进一步探究及证明该RBD插入序列对miRNA加工的影响，及miRNA合成加工的机理提供了一定的理论支持。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1质粒的构建 2
1.2细胞的培养及转染 3
1.3蛋白质的表达、纯化及检测 3
1.3.1原核表达中的谷胱甘肽s转移酶标签蛋白纯化（GST）3
1.3.2真核蛋白的表达与纯化3
1.4 蛋白质与premiRNA的体外反应4
1.4.1 Dicer体外切割反应premiRNA4
1.4.2 DicerRBD与RNA结合4
1.5 细胞内培养4
1.5.1 载体构建及细胞转染5
1.5.2 报告基因的检测5
1.6 荧光定量PCR检测细胞miRNA表达5
2结果与分析5
2.1蛋白的表达5
2.2 RBD突变影响Di *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
cer体外加工premiRNA6
2.2.1 Dicer的切割反应6
2.2.2 DicerRBD与RNA结合7
2.3细胞内Dicer蛋白功能分析8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
引言
microRNA（miRNA）是一类大小在22个核苷酸（nt）左右，广泛表达于多细胞生物体内的小分子非编码RNAs[1][2]，能够通过与靶基因转录所得的mRNA 3’端的非编码区域(untranslated region, UTR）互补序列(miRNAresponse element, MRE)互补结合，从而从转录或翻译水平上降低靶基因的表达[1]，参与调控细胞多种生命活动[6][7][8]，并且与多种人类疾病的发生息息相关 [9][10]。miRNA的细胞内合成起始于细胞核内，由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）指导发生转录，合成具有茎环结构的前体miRNA (primiRNA)，紧接着，primiRNA由核内Drosha蛋白与DGCR8结合形成的全酶复合体切割为具有发卡结构的precursor miRNA (premiRNA)，由RanGTP依赖性的Exportin 5 (XPO5)蛋白转运至细胞质中，进行进一步的加工。细胞质中的Dicer蛋白将进一步对premiRNA进行剪切加工并形成双链miRNA，双链miRNA的其中一条链与Argonaute (AGO)蛋白结合形成成熟的miRNA [3][5]，另一条链则降解失活。
Drosha及Dicer均属于RNase Ⅲ家族，同为双链RNA结合蛋白（dsRNAbinding protein），在加工过程中，两者均通过其肽链C端存在的RBD（doublestranded RNAbinding domain）识别并结合primiRNA及premiRNA[4]。Drosha具有两个RⅢD（RNase Ⅲ 结构域）及一个RBD，其肽链N端包含一个脯氨酸富含区域（Prich）和一个丝氨酸/精氨酸富含区域（R/Srich），两者均在与RNA的相互作用中起到重要作用[11]。Dicer的同源物序列约有200kDa，包含多个结构域，包括两个RⅢD，一个RBD，其N端序列较长，包含DExH RNA解旋酶/ATPase、DUF283及PAZ结构域[11]。已有的研究表明，Dicer能够通过PAZ与miRNA 的3’端进行识别并结合，以实现固定miRNA的功能。
有证据显示，Drosha及Dicer的功能具有一定选择特异性，能够通过调节与primiRNA及premiRNA的结合位点，得到不同的加工结果，从而使得同源的miRNA编码序列具有表达的多样性[19][20][22]。其中Drosha能够通过决定产物premiRNA 3’端的末端序列，从而影响后续EXP5和Dicer对premiRNA的识别[12][13][14]。在Dicer的加工中，PAZ与RBD是其与premiRNA进行结合的主要功能区，两个RⅢD会在dsRNA上形成一个内二聚体结构，启动对RNA链的切割。其中，PAZ与RⅢD之间的距离会决定miRNA结合Dicer的转角方向，从而对切割后miRNA双链的长度造成影响[15]，但具体的识别机制尚不明确。
RBD又称dsRM，在RNA结合蛋白中作为重要的功能区普遍存在，一般包含约7075个氨基酸，具有保守的αβββα拓扑结构，其特异性识别RNA的能力主要来自于它的α1螺旋及存在于肽链C端的氨基酸残基 [16]。但是在大部分体外试验中，尚缺乏RBD与RNA直接结合的实验证据，因而其在RNA加工中具体发挥的功能仍尚不明确。Drosha与Dicer的RBD结构类似，但是人源及部分果蝇源Drosha的RBD序列相较于DicerRBD以及其他众多RNA结合蛋白的RBD存在一个特殊的保守插入序列，指导编码了包含6个氨基酸的一段短肽，位于DroshaRBD 中α1β1连接的位置[4]。已有的报道显示，该插入序列对Drosha的功能至关重要，与其RNase Ⅲ 酶活性息息相关。（在体外实验中）缺乏该插入序列的突变型Drosha与RNA的结合能力将会显著降低，甚至不参与对primiRNA的加工，但是在该过程中该插入序列所起到的具体作用仍尚不明确[4]。为此，该课题中，通过将这段插入序列引入同一物种细胞的DicerRBD中，构建突变型Dicer，有助于进一步研究这一特殊插入序列对RNA结合蛋白识别、结合RNA功能的具体影响，以及其对miRNA加工的影响，探究该序列的功能是否存在特异性。

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