目录
摘 要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
引言： 1
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 实验菌株、质粒、试剂 3
1．1．2 菌株培养 3
1．1．3 培养基 3
1．1．4 主要仪器与设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 构建DNMT1沉默表达载体 3
1．2．1 .1 片段扩增 3
1．2．1 .2 PCR产物的回收和载体连接 4
1．2．1 .3 大肠杆菌转化 5
1．2．1 .4质粒提取 5
1．2．1 .5测序验证 6
1．2．1 .6酶切酶连 6
1．2．2转化灵芝 6
1．2．3筛选阳性转化子 7
1．2．4灵芝三萜测定 7
2 结果与分析 7
2．1目的片段扩增 7
2．2双酶切电泳检测图 8
2．3灵芝DNMT1沉默载体的构建 8
2．4 沉默转化子筛选 8
2．5灵芝三萜含量 9
2．6分析与讨论 10
3 不足与展望 11
3．1 不足之处 11
3．2 展望 11
致谢 11
参考文献： 12
基因组DNA甲基转移酶调控灵芝三萜生物合成的作用分析
摘 要
DNA甲基化是指在生物体进行DNA复制之后，通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化作用，以S腺苷甲硫氨酸( Sadenosylmethionine, SAM)为甲基供体，将DNA分子碱基与SAM的甲基基团共价结合。负责催化DNA甲基作用的酶称为DNA甲基转移酶。根据DNMTs结构和功能的不同，可以将DNMTs分为两类，一类为DNA甲基化维持酶，另一类为DNA从头甲基化酶。DNMT1是维持甲基化酶，它具有调节细胞周期和调控肿瘤抑制基因表达 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
的功能，在机体各类疾病中发挥着一定的作用。灵芝是传统食药用真菌之一，在我国被广泛知晓，灵芝三萜是其中主要的药用活性成分之一。本课题通过构建两个灵芝DNMT1甲基转移酶同源基因共沉默载体，转化并筛选获得阳性转化子。检测沉默灵芝DNMT1基因对灵芝三萜含量的影响，结果显示DNMT1共沉默转化子中灵芝三萜含量显著高于野生型。这一研究说明，DNMT1能够影响灵芝三萜的生物合成，为进一步研究DNA甲基化转移酶调控灵芝次生代谢产物生物合成机制以及影响灵芝其它生理过程提供研究基础。
引言
在经典遗传学发展的过程中，却有一些不符合经典遗传规律的现象被科学家发现了，这种现象被叫作表观遗传。表观遗传学最早由Waddington提出，指DNA的碱基排列顺序没有发生变化但性状却发生了改变，并且能够稳定遗传给后代的现象[1]。主要内容包括染色质修饰和重塑、DNA甲基化等[2]。有科学家发现，DNA甲基化能够改变真核细胞的染色质结构，使得DNA在A、B、C、Z四种不同的物理空间结构之间发生转变，改变DNA双螺旋空间结构的稳定性等，以此调控真核生物的把来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程 [3]。DNA中6氨基嘌呤的N6位、2氨基6羟基嘌呤的N7位和4氨基2羰基嘧啶的N4位和C5位都可以进行甲基化过程，其中最常见的是4氨基2羰基嘧啶的C5位修饰，也就是C5胞嘧啶甲基化。C5胞嘧啶甲基化是指由SAM提供的CH3基团作为起始条件， DNMTs的催化作用作为反应条件，最终和C5胞嘧啶生成5甲基胞嘧啶的化学反应过程。[3]。DNA甲基化是存在于自然界各种动植物中的一种较为普遍的修饰方式，其功能涉及到生长发育等多个方面，包括：（1）维持遗传信息的稳定，植物基因组中正常情况下会包含许多的转座子序列，然而转座子的激活可能会使得基因的遗传信息容易发生改变，但是一般情况下转座子序列会被高度甲基化，从而维持了植物基因组的稳定性[4]。（2）响应生物胁迫与非生物胁迫，在有关植物的胁迫应答研究中，已经有大量研究表明，某个基因通过不断变化的DNA甲基化，从而直接参与调节不同情况下例如重金属或者高温等条件下的胁迫应答，例如植物和病原体相互作用时，由于DNA的去甲基化激活了植物的防御基因，而处于侵染阶段，相关基因的甲基化水平降低又会导致病原体相应基因的表达量增多[3]。也有众多科学家进行了实验并报道了在铝、盐、活性氧或者低温等胁迫下，DNA甲基化程度和特定胁迫应答基因表达量的改变存在一定关联性[3]。
DNA甲基化由一类被称为DNA甲基化转移酶的蛋白家族催化而成，SAM为该蛋白家族提供甲基基团，该蛋白家族把SAM结构上面的甲基转移到基因组CpG( Cytosine phosphoric acid Guanine, CpG)二核苷酸胞嘧啶5，碳位上，最终生成5甲基胞嘧啶[5]。DNMTs在真核生物中被分为DNMT1、DNMT2、DNMT3和染色质甲基化酶四个类别，其中染色质甲基化酶只存在于植物当中[6]。DNMT1被称为维持甲基化转移酶，1988年Bestor等人从真核生物中提取出来的第一个DNA甲基转移酶就是胞嘧啶C5特异的甲基转移酶DNMT1 [7]。DNMT1是真核生物甲基化的关键：除了少数真菌，所有植物、动物和大部分真菌都存在有DNMT1。在绿藻、家蚕、接合菌纲和担子菌中都具有DNMT1介导的DNA甲基化，并且在家蚕和担子菌中只存在有DNMT1，说明至少在某些物种中，DNMT1是用来建立和维持甲基化的[8]。DNMT1全长1620aa，由两个结构域组成，其中前1100aa组成酶的调节结构域，剩余氨基酸残基构成催化结构域，两个结构域之间通过重复的甘氨酸赖氨酸序列连接，需要两个结构域均完整才能完成催化的功能[9]。DNMT2虽然被称为DNA甲基转移酶，但研究表明它并不进行DNA甲基化过程，而是特异性地负责天冬氨酸tRNA中氨基酸臂对面的单链环第38位胞嘧啶甲基化，并且已被更名为TRDMT1[10]。DNMT3被称为从头甲基化转移酶，在未甲基化CpG位点上增添甲基基团，从而形成5甲基胞嘧啶[9]。所有的DNA甲基转移酶共同含有高度保守的催化结构域，这一功能域被称为S腺苷L蛋氨酸( AdoMet)依赖的甲基转移酶折叠[11]。有关哺乳动物的相关实验表明，DNMT1缺失的小鼠容易在胚胎期就死亡，并且其全基因组DNA甲基化水平大幅下降，说明DNMT1对于小鼠的胚胎发育有着极其重要的作用[6]。在昆虫中研究相关DNMT功能时结果也表明，DNMT在昆虫的生长发育过程中扮演着重要的角色。由于复杂的生活环境，昆虫中的DNA甲基化模式发生了改变，使得其在表型分化、繁殖力和适应性等方面有很大的不同，从而适应了各种不同甚至极端的环境[12]。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606522.html