没食子酸-壳聚糖的合成与体外抗肿瘤活性研究
摘要：目的：利用氨基和羧基缩合反应合成没食子酸-壳聚糖聚合物，制备没食子酸-壳聚糖-EGCG纳米粒(Gallic Acid-Chitosan-EGCG Nano)，研究纳米颗粒的物理化学性质。测试聚合物和纳米粒对体外培养的肝癌细胞HepG2、胃癌细胞BGC-823的抗肿瘤活性。方法：制备的纳米颗粒用动态散射仪测其粒径大小，利用电位仪测量纳米粒表面电位，采用台盼蓝染色细胞计数法测定没食子酸-壳聚糖纳米复合物对HepG2、BGC-823的增殖抑制作用。结果：纳米颗粒的粒径在300nm左右，表面电位为+30mV。没食子酸-壳聚糖聚合物的肿瘤抑制效果较弱。没食子酸-壳聚糖-EGCG纳米粒作用24h、48h、72h 后，实验组均出现了不同程度的增殖抑制，抑制效果随时间逐渐增加并具有浓度依赖性。与聚合物对照组相比，高分子的纳米粒抑制增殖作用更显著。结论：没食子酸-壳聚糖纳米粒对EGCG具有协同增效作用，在体外发挥良好的抗肿瘤效果，可作为新型材料应用于食品、医药领域。
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关键字:没食子酸-壳聚糖；纳米；EGCG；抗肿瘤；台盼蓝；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 没食子酸-壳聚糖聚合物制备3
1.2.2 没食子酸-壳聚糖聚合物接枝率测定3
1.2.3 没食子酸-壳聚糖-EGCG-纳米粒制备表征 3
1.2.4 细胞培养方法 3
1.2.5 MTT法检测肿瘤抑制率4
1.2.6 台盼蓝细胞染色计数法测肿瘤抑制率4
1.2.7 统计学处理5
2 结果与分析5
2.1 没食子酸-壳聚糖聚合物接枝率测定结果5
2.2 没食子酸-壳聚糖聚合物抗肿瘤活性5
2.3 没食子酸-壳聚糖纳米粒制备表征结果5
2.4 没食子酸-壳聚糖纳米粒抗肿瘤活性5
2.5 EGCG-纳米粒对肝癌细胞HepG2的抗肿瘤活性7
2.6 EGCG-纳米粒对胃癌细胞BGC-823的抗肿瘤活性9
3 讨论12
致谢12
参考文献13
没食子酸-壳聚糖的合成与体外抗肿瘤活性研究
引言
多酚是高等植物的次级代谢产物，对人类健康有着潜在的作用，具有较好的抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抑菌等活性[]。研究发现多酚与多糖的复合物也具有良好的抗氧化、抗凝血等生物活性。Izabela Pawlaczyk[]发现从传统药物植物中提取的植物多酚-多糖复合物具有良好的抗凝血特性。Joanna Saluk-Juszczak[]发现菊科的植物中提取 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的多酚-多糖化合物具有多种生物活性，包括抗血小板凝固和抗氧化性能。多酚-多糖等复合物的抗肿瘤活性研究将是一个新的方向，应用研究前景广阔。可通过将其他官能基团引入壳聚糖大分子中，或通过接枝、共混改善其性能。官能基团改性法有酞化改性、烷基化改性、醚化改性、Shiff碱改性等[]。没食子酸-壳聚糖是由没食子酸的羧基和壳聚糖的氨基通过缩合反应制得的一种水溶性壳聚糖衍生物，可成为较好的抗肿瘤药物EGCG的靶向载体。
EGCG是一种从绿茶中提取分离的多酚类生物活性物质，对人体无毒性、耐受性[]。并且EGCG具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎等生物活性[]，对多种癌症和其它慢性疾病有化学预防作用。1988年日本科学家首次证明了EGCG具有抗肿瘤的生物学功能[]。其主要抗肿瘤机制是抗氧化及抑制脂肪酸合成[]、与细胞内蛋白分子结合抑制肿瘤细胞增长[]、调节细胞周期[]、对肿瘤细胞相关凋亡蛋白的调节[]、抑制生长因子信号传导途径[]、抑制细胞内转录因子的活性[]以及抑制肿瘤血管的形成[]等。EGCG在体内较低的生物利用率，低效的给药系统以及对肿瘤组织较弱的定向攻击都影响了EGCG功能的发挥[]。将EGCG包埋在没食子酸-壳聚糖纳米粒子载体中可以提高EGCG的生物利用率，体现剂量优势。
纳米技术是近年来的一种高新技术，指在纳米尺寸范围内，通过直接安排和操作分子、原子，创造研制新型物质[]。可广泛应用于材料学、电子学、生物学等多个领域，尤其是在生物医学领域，纳米科技有着十分广阔的应用前景。纳米药物具有的缓释作用、靶向给药、高效利用、稳定性好、刺激性小等特点，因此将纳米技术应用于药物研究是现代医学发展的重要方向[]。纳米技术在医药上的许多成果正逐渐被应用于食品行业，不仅提高了食品生产的效率，改进了工艺，还研发了许多具有更好功效、特殊功能的新型食品和保健食品[]。关注点逐渐转向研究食品和营养素经纳米化产生的新功能和新特性，如提高生物利用率、增强缓释控制、提高靶向型和生物活性(抗氧化、抗突变、抗菌、抗肿瘤)等方面。因此，开发无毒副作用、具有预防和复制治疗癌症的纳米功能食品将具有重大价值和发展前景。
HepG2和BGC-823都是人体常见的肿瘤细胞[]，并且肝脏和胃是与人摄取的食物发生作用的主要器官，因此本实验选用这三种细胞作为体外抗肿瘤活性研究模型。本实验以自合成的GA–CS作为载体，制备包埋EGCG的GA–CS纳米颗粒。
本课题将EGCG药物制备与纳米技术结合起来，以没食子酸-壳聚糖作为包载抗肿瘤药物EGCG的载体制备样品纳米颗粒，从而提高EGCG的缓释和利用率，提高药效。在此基础上，通过细胞实验探索新型纳米材料对肝癌和胃癌细胞的体外抗肿瘤活性。以期获得具有高稳定性、抗氧化性能、缓释特性和抗肿瘤活性的新型纳米材料。并展望其作为食品添加剂或药物的可能性。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞株
人肝癌细胞株HepG2，胃癌细胞株BGC-823均由本实验室提供。
1．1．2 试剂
没食子酸(GA，Mw:188.3，国药集团化学试剂有限公司，批号F20050324)；低粘度壳聚糖(Chitosan，Mw：1.5×105，脱乙酰度：>90%，批号T0060)； 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐( *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
EDCHCl，Mw:191.7，批号Q0071)；冰醋酸(Mw:60.05，国药集团化学试剂有限公司，批号T20110725)；RPMI-1640培养液、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NBS) ( GIBCO公司)；磷酸缓冲盐(PBS)；胰蛋白酶(DMEM，Gibco公司产品)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，AMRESCO公司)；透析袋(相对截留分子量3500-4000KD，进口分装)；台盼蓝染料(Trypan blue，Mw:960.81，吸光波长607nm，批号S0052)；其他试剂均为分析纯。
1．1．2 试剂
高速离心机（ANKE TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；
数显恒温水浴锅(HH-6，常州普天仪器制造有限公司) ；
磁力搅拌器(MS-H280-Pro，SCILOGEX)；
XW-80A型旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；
pH计（DELTA 320，梅特勒-托利多仪器有限公司）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科技有限公司）；
冷冻干燥机（Telstar公司）；超低温冰箱(BCD-232e，Electrolux)；
电子精密天平（AY-120）、分析天平（BL-220H，日本Shimadzu）；
可见分光光度计(722S，上海菁华科技仪器有限公司)；
数控超声波清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）；
CO2恒温培养箱(THERMO SCIENTIFIC)；
图2-5-2-3EGCG-聚合物纳米粒对HepG2细胞抑制率72h
用浓度为12.5、25、50、100、200μg /m L的EGCG进行抗肿瘤实验，结果见图2-5-2。结果显示，随着EGCG的浓度逐渐增加，肝癌细胞HepG2的存活率逐渐降低。采用直线回归方法计算得出EGCG对HepG2细胞的半数抑制浓度IC50为87.77μg /m L。远高于接枝率20的EGCG-聚合物纳米粒的半数抑制浓度50.69μg /m L和接枝率70的EGCG-聚合物纳米粒的半数抑制浓度53.12μg /m L。说明低浓度的EGCG-聚合物纳米样品也可以在同等程度下达到EGCG的抗肿瘤效果。
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spkxygc/12847.html
