目 录
1 引言1
1.1 扁玉螺的特性及营养价值1
1.2 扁玉螺多糖甲基化的发展现状及前景2
1.3 扁玉螺多糖甲基化注意点2
1.4 本课题研究的目的和意义2
2 实验材料和方法3
2.1 实验材料3
2.2 研究方法3
2.3 实验设计4
3 结果与分析7
3.1 DEAE-纤维素柱层析法7
3.2 多糖组分基本理化性质分析7
3.3 红外光谱分析12
3.4 甲基化反应及GC-MS分析18
结论 17
致谢 18参考文献191 引言
扁玉螺(Neverita didyma)俗称“肚脐菠萝”、“香螺”[1]，随着对海洋生物资源的进一步开发和对糖类药物研究的日益重视，海洋动物多糖的研究与开发越来越受到国内外学者的广泛关注[2]。我国海域辽阔, 海洋生物资源丰富，海洋贝类资源的高效利用和深度开发是我国经济贝类养殖业可持续发展的重要研究方向，其中扁玉螺多糖因其独特的结构，在抗肿瘤、抗病毒、免疫调节和肝损伤保护等多个方面显示出广泛的生物活性，在功能性保健食品和创新药物的研究与开发方面具有良好的应用前景。
测定多糖链中各种单糖残基的连接方式，甲基化分析是重要手段之一。其基本原理是将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖进行完全酸水解，水解得到的羟基与NaBH4还原醛基产生的羟基再经乙酰化可得到部分甲基化的糖腈乙酸酯，通过GC-MS联机测定，比较分析气相色谱中各种单糖残基的出峰次序、质谱图中出现的主要离子碎片便可准确地判断各种单糖残基之间的连接键型。同时根据不同甲基化单糖的比例可推测出 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
连接键的类型在多糖重复结构中的比例[2]。
1.1 扁玉螺的特性及营养价值
1.1.1 扁玉螺的特性
扁玉螺(Neverita didyma)俗称“肚脐菠萝”、“香螺”，隶属软体动物门、前鳃亚纲、玉螺科。该螺生活于潮间带至浅海50 ｍ的细沙泥质海底 ,属广温性种类，我国南北沿海均有分布。一般说来，海产贝类都具有高蛋白、低脂肪等特性，作为食用贝类，它们不但营养价值高、口味鲜美，而且具有保健、养颜、美容、抗衰老等功效。扁玉螺是我国沿海的重要经济腹足类，其个体大、肉味鲜美、食后口余清香，广为沿海居民喜爱[3]。
1.1.2 扁玉螺的营养价值
经查阅资料发现，扁玉螺肉中水分含量为78.6%，总糖含量为4.6%，粗蛋白含量为9.2%，灰分为5.7%、粗脂肪含量为1.3%[4]。扁玉螺肉的蛋白质含量（以干基计）为44.1%，脂肪含量（以干基计）为11.1%。并且不同地区产的扁玉螺在营养特性方面存在一定差异。另外，扁玉螺肉中不饱和脂肪酸的量占到脂肪总量的67.7%。此外还含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖，木糖、甘露糖等，多糖含量丰富，营养价值很高，富含丰富的蛋白质和脂肪。多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子，具有抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、降血压和增强免疫力等功能[5]。
1.2 扁玉螺多糖甲基化的发展现状及前景
1.2.1 扁玉螺多糖的研究现状
2009年，刘庆，徐兴华，陈燕妮等人对扁玉螺的形态以及行为与繁殖生物学进行了初步研究，为后来的扁玉螺多糖提取研究实验奠定了基础。杨丽红，刘辉等人相继对扁玉螺多糖的提取，含量测定，分离纯化进行研究，并发表文章[6]，而早在1988年张国文就开始了多糖甲基化的研究，后来经过李波，方积年等人的不断研究，完善了多糖甲基化方法和图谱分析，为我们的实验提供了可行方案。蒋长兴老师曾做过扁玉螺多糖的分离鉴定及生物活性研究，扁玉螺多糖的免疫活性的研究，殷秀红, 赵峡, 张紫恒等人也做过紫贻贝多糖的提取、分离和基本理化性质分析，现在对于生物多糖的提取和测定是生物研究中的一大热门[7]。
1.2.2 多糖甲基化的研究现状
多糖的甲基化方法经历了多年的发展变革，逐渐趋于简单合理。1964年，Hakomari以甲基亚磺酰负离子（CH3SOCH2）为强碱，碘甲烷为甲基供体。1984年，Ciucanu和Kerek用NaOH代替CH3SOCH2作为强碱，由于省去了制备CH3SOCH2的复杂步骤，因而大大简化了操作[8]。1993年，Needs和Selvendran对Ciucanu法进行了改进，先加入NaOH使糖的羟基充分解离后，再加入碘甲烷使羟基迅速甲基化，减少了多糖氧化降解的可能性。对于难溶于二甲亚砜（DMSO）易溶于水的多糖，可将其先用少量水溶解，再转溶于DMSO，然后用3A分子筛脱除其中的水分，再进行甲基化反应，但该法多糖用量较多[9]。
1.3 扁玉螺多糖甲基化注意点
甲基化反应时，多糖样品的用量可低至0.1 mg。若样品溶解度较低，可适当增加其用量。二甲亚砜采用分析纯试剂即可，无需专门制备。固体氢氧化钠在临用前用研钵磨成粉末状即可，但速度要快，因氢氧化钠粉末很容易吸潮。充入氮气的目的是为了防止多糖发生氧化反应。因碘甲烷容易挥发，所以应先充氮，再加碘甲烷。加入碘甲 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
烷后，至少反应20 min。一般加入2次碘甲烷（即2次甲基化反应）即可达到完全甲基化，亦可根据情况增加甲基化反应次数和时间[10]。
1.4 本课题研究的目的和意义
本课题以扁玉螺为实验材料，采用DEAE-纤维素柱层析法方法，将多糖分离纯化后，进行甲基化测定，再通过GC-MS联机测定，比较分析气相色谱中各种单糖残基的出峰次序、质谱图中出现的主要离子碎片，判断出各种单糖残基之间的连接键型和多糖结构。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验原料
扁玉螺，购买于淮安农贸市场。
2.1.2 实验试剂
无水乙醇、氢氧化钠粉末，碘甲烷，二甲基亚砜等：均为分析纯试剂
2.1.3 实验仪器与设备
表2-1 仪器设备图
名称 型号 生产厂家
分析天平 FA2004N 上海菁海仪器有限公司
超低温冰箱 EDW-40-108LA 艾德生仪器有限公司
旋转蒸发器 Laborota-400型 Heidolph
台式恒温振荡器 THZ-98型 太仓华美生化仪器厂
数显恒温水浴锅 HH-4型 常州国华电器有限公司
循环水式真空泵 SHB-Ⅲ型 郑州长城科工贸有限公司
透析袋 3500 Da、14000 Da 上海绿鸟科技发展有限公司
层析柱 2.6 × 30 cm，2.6 × 60 cm 上海亚荣生化仪器有限公司
自动部份收集器 DBS-100A型 上海沪西分析仪器厂
数显恒流泵 DHL-2B型 上海沪西分析仪器厂
图3-10 扁玉螺多糖纯化组分-1甲基化后红外光谱图
2,3,4,6-四甲基半乳糖 16.075 1.627 Gal-(1→
2,4,6-三甲基葡萄糖 16.192 1.218 →3)-Glc-(1→

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