新型绿色萃取剂在食品功能成分萃取中的应用研究
*景先生毕设|www.jxszl.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
ctive than in methanol. The ultrasonic extraction conditions of the ChGly-based were optimized, including the ChGly content in the extractant, temperature, and time for UAE. In the optimum conditions(80.% ChGly, 30 min, 60 ℃)，the amount of rutin is 36.5 mg/g with extraction efficiencies of 95.0.%. Compared with the conventional methanol-based method, ultrasound-assisted NADES extraction required 1/8 less time in the same conditions. Using water as anti-solvent, we recovered 90.% of the extracted rutin from NADES. The structure of the purified rutin was confirmed by NMR. The present study shows that NADESs can be used as green and safe extraction media for bioactive ingredients.荞麦（Buckwheat）为蓼科荞麦属植物。我国主要种植的是普通荞麦和鞑靼荞麦两种，前者称甜荞（Fagopyrum esculentum Moench），后者称苦荞（Fagopyrum tataricum Gaerth）。荞麦作为药食同源植物，现代研究表明，荞麦中含有其他谷物不含的黄酮类化合物，如芦丁、槲皮素、山奈酚等[1]。研究表明，苦荞中的黄酮类化合物高达3 %-5 %[2,5]。芦丁（quercetin-3-O-rutinoside）是甜荞和苦荞中最主要的黄酮类化合物[5]。芦丁具有多种药理作用，如抗炎、抗高血压以及抗氧化性[5]。另外，苦荞种子里还含有普通荞麦里没有的槲皮素和槲皮苷 [5,6]。荞麦中的芦丁及其他黄酮类化合物不能由人体合成[7]。因此，苦荞成为了人体摄入芦丁的主要来源[8]。 迄今为止，几乎所有涉及到从荞麦中萃取芦丁所使用的萃取剂都是有机溶剂或者是水-有机溶剂混合物[4,8]。然而，有机溶剂存在的一个问题就是产生了大量的垃圾。一般有机溶剂有毒且具有挥发性，对环境造成了污染。因此，使用成本低且对苦荞芦丁萃取的无毒溶剂体系迫在眉睫。 有人建议几种溶剂，包括离子液体作为“绿色”溶剂来代替挥发性的有机溶剂。离子液体其可忽略的波动性及非易燃性促使其成为合格的绿色溶剂[9]。然而，最近的一些研究指出了离子液体的一些缺点，如毒性，可生化性差以及合成成本高，这些缺点有损于其“绿色性”[9,10]。最近，天然的低共熔溶剂[11,12]作为一种深共晶溶剂[13,14]，已被公认为一类新的可持续溶剂。这些溶剂是由两种或者多种天然的，廉价的以及可生物降解的成分通过氢键相互作用，形成一个共晶混合物[11,12]。原则上来讲，低共熔溶剂是由氢键供体（HBD）以及氢键受体（HBA）正确结合而形成的[11,13]。 大多数的低共熔溶剂是由不同成分构成的，已研究的包括有氯化胆碱，尿素，有机酸，多元醇以及糖等。低共熔溶剂通常是安全的，无毒的，因此比起离子液体来说较好。最近，低共熔溶剂在各种学科和技术领域方面获得了越来越多的关注 [11,12,15-17]。可持续溶剂最重要和最广泛的应用则是应用与萃取过程。医药和生物化学工业领域认为，使用可持续溶剂，从生物质中绿色且有效的萃取天然产物是非常重要的。 在本研究中，将超声和低共熔溶剂结合起来，可以有效的萃取生物活性成分。我们的目的是将超声与低共熔溶剂结合方法的潜力最大的挖掘出来，以便更有效的从苦荞中萃取芦丁。萃取之后，对从中萃取的芦丁进行表征。经核磁共振表征纯化芦丁的结构。1 材料与方法1.1 试剂苦荞购于中国四川凉山。芦丁标品（纯度≥95.%）购于Sigma公司。甲醇和乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。低共熔溶剂的组分包括：氯化胆碱(≥98.0.%)，甘油(≥99.0.%)，1,2-丙二醇，葡萄糖(≥99.5.%)，蔗糖(≥99.5.%)，丙二酸(≥99.0.%)，苹果酸(≥99.0 %)，柠檬酸(≥99.5 %)，酒石酸(≥99.5 %)，木糖醇(≥99.0 %)和山梨醇(≥99.0.%)，均购于阿拉丁化学试剂有限公司。所用溶剂及其他试剂均为市售分析纯。1.2 主要仪器设备高效液相色谱仪：配备G13llA泵和可变波长紫外测器购自美国Agilent公司色谱柱：Zorbax Eclipse XDB—C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）购自美国Agilent公司紫外分光光度计：UV Bluestar A，北京莱伯泰科仪器有限公司数显恒温水浴锅：型号HH-1，金坛市科析仪器有限公司电子天平：型号BSA224S-CW，北京赛多利斯科学仪器有限公司流变仪：型号MCR 301，奥地利安东帕公司1.3 标准曲线的制备将芦丁溶于甲醇得到浓度为1.0 mg/ ml的母液，稀释母液得到浓度为50，100，200， 300，400和 500 μg /mL的溶液。1.4 制备低共熔溶剂 在本研究中，氯化胆碱作为氢键受体与氢键供体（醇类、糖类或有机酸）合成的十种氯化胆碱型的低共熔溶剂见表1。通过搅拌两组分，并在适宜的温度下加热（≤100 °C）直至形成均一的溶液，得到的液体放置在干燥器中直至恒重。在40 ℃下进行粘度实验。极性实验使用尼罗红(NR)作为溶剂致变剂。染料溶解在低共熔溶剂中，浓度为0.1 mM，染料的吸收峰(λmax)由紫外分光光度计测得。计算公式为ENR (kcal/moL) = hcNA/λmax = 28,591/λmax[11] 。表1 低共熔溶剂缩写成分1(氢键受体)成分2(氢键供体)摩尔比室温下形态ChP1,2-丙二醇1:1透明液体ChGly甘油1:1透明液体ChGlu葡萄糖2:5淡黄色液体ChSu蔗糖1:1淡黄色粘性液体ChX氯化胆碱木糖醇1:2透明粘性液体ChS山梨醇2:5透明粘性液体ChM丙二酸1:1透明液体ChMal苹果酸1:1透明粘性液体ChC柠檬酸1:1淡黄色液体ChT酒石酸1:1透明粘性液体1.5 芦丁在不同溶剂中的溶解性 将芦丁溶于低共熔溶剂、水以及甲醇中，形成饱和溶液，在40 ℃下溶解1 h，为了使其溶解充分，40 ℃下超声1 h。在10000 rpm下离心20 min，上清液稀释后过膜（0.45 μm），供液相色谱分析。1.6 萃取芦丁 在2 ml离心管中加入1 ml萃取剂，加入40 mg苦荞粉末，涡旋振荡。在40 ℃下超声1 h，10000 rpm下离心30 min，对照组为传统萃取剂80 %甲醇，用于萃取苦荞中的芦丁。采用高效液相色谱分析法对其萃取率进行了测定，并采用以下公式计算萃取量：芦丁质量（mg）/苦荞质量（g）。进行机械搅拌萃取，优化萃取效率的方法为：1 g样品溶于25 ml 80 % 的甲醇中，搅拌效率保持在250 r/min。1.7 高效液相色谱法测定芦丁含量色谱柱为美国Agilent.公司的Zorbax Eclipse XDB—C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），配有Agilent G1311A泵和波长可调为257 nm的紫外检测器；流动相为甲醇：水（1：1 v/v），流速保持在0.6 mL/min。用甲醇将样品稀释50-100倍之后，经有机膜（0.45 μm）过滤。芦丁出峰时间为3.55 min。线性方程为：y = 47602x−2000000 (R2 = 0.990)。线性范围为50–500 μg/ml。1.8 芦丁分离纯化过程 1 g苦荞加15 ml 80%甲醇置于100 ml具塞三角瓶中，涡旋振荡，然后进行如上所述的超声辅助萃取，萃取之后，样品离心30 min，10000 rpm。取上清液并加入20倍体积的水。在0 ℃下静置4 h，离心30 min, 10000 rpm。用甲醇-水的混合物(6：4,v / v)作为洗脱剂，通过半制备高效液相色谱法进一步纯化产物。1.9 纯化芦丁的结构测定从苦荞中萃取的芦丁经核磁共振表征。瑞士Bruker公司的布鲁克皇冠av-500仪，记录了芦丁的核磁共振谱；DMSO为溶剂。芦丁: C27H30O161H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.61 (1H, s, 5-OH), 10.82 (1H, s,7-OH), 9.65 (1H, s, 4-OH), 9.16 (1H, s, 3-OH), 7.56 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-2), 6.88 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.41 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.22 (1H, d, J =1.7 Hz, H-6), 5.37 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-1″), 4.42 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-1), 1.03 (3H, s, H-6).13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ 177.3 (C-4), 164.0 (C-7), 161.2 (C-5), 156.6 (C-9), 156.3 (C-2), 148.3 (C-4), 144.7 (C-3), 133.2 (C-3), 121.5 (C-6), 121.1 (C-1′), 116.2 (C-5), 115.1 (C-2), 103.9 (C-10), 101.1(C-1), 100.6 (C-1), 98.6 (C-6), 93.5 (C-8), 76.4 (C-5), 75.8 (C-3), 74.0 (C-2), 71.8 (C-4), 70.5 (C-2),70.3 (C-3), 69.9 (C-4), 68.1 (C-5), 66.9 (C-6), 17.6 (C-6).1.10 数据分析 所有实验均为三个对照，结果为平均值±标准差。方差分析，其次是邓肯氏多个范围测试。P值＜0.05为有统计学意义。所有的统计分析采用统计软件（SAS，8.01版）。2 分析与讨论2.1 初始萃取条件的选择 由于芦丁在水中的溶解性（90 μg/ml）非常的低（见表2），所以各种有机溶剂，包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，作为常用的萃取溶剂与一些萃取方法如热回流萃取，搅拌，加热相结合。然而，这些方法通常需要大量的溶剂和较长的萃取时间。 不同含水量的醇-水溶液是萃取黄酮类化合物的一般溶剂。特别是甲醇及其水溶液是最常用的萃取苦荞中芦丁的溶剂。纯甲醇与80%甲醇作比较，结果表明80 %甲醇萃取效果较好。因此，80 %甲醇作为对照萃取溶剂与各种低共熔溶剂作对比。表2 芦丁在水、甲醇及各种低共熔溶剂中的溶解度及相关物理化学参数溶剂溶解度b (mg/ml) a粘度 (40 °C) c (Pa.s)极性e(kcal/mol)ChGly142.12±3.303.1850.91ChGlu108.56±2.013.5050.07ChX105.20±2.214.5049.81ChC55.50±1.216.6752.85ChMal25.50±1.212.6151.75Methanol96.50±4.210.0151.80Water0.09±0.01-- d--a高效液相色谱测得40 ℃不同饱和溶液中芦丁的溶解度；b 平均值±标准差 (n=3)；c检测剪切速率0.268[1/s]；d 未检测到；e 极性=hcNA/λmax 低共熔溶剂被认为.是一种较好的溶解和萃取水溶性化合物的媒介[11]。在本研究中，芦丁的溶解性在几种氯化胆碱型的低共熔溶剂中比在水中提高了283~1577倍（见表2）。这种特性能够使它在低水溶性的条件下溶解更多成分。表2显示低共熔溶剂的极性与甲醇相似。因此，低共熔溶剂被认为是极性较大的溶剂。大多数萃取方法，包括热回流萃取，搅拌，加热，搅拌/加热组合和超声辅助萃取，都可以使用低共熔溶剂。然而，由于低共熔溶剂的低挥发性及高粘度性，因此其并不适用于最常用的热回流方法（见表2）[11,12]。在本研究中，最初选择超声辅助萃取是因为其简单，快速，有效以及其可用于非溶剂型的萃取过程。2.2 低共熔溶剂对芦丁萃取效率的影响 低共熔溶剂的一个最主要的优势是有针对性，原因是其成分的多样性。考虑到萃取技术，低共熔溶剂萃取和分离的选择性可以通过改变氢键组分的摩尔比实现。十种不同的氯化胆碱型的低共熔溶剂（见表1）用于萃取芦丁。芦丁的萃取率取决于低共熔溶剂的种类（见图1）。在这十种低共熔溶剂中，氯化胆碱-甘油相比其他低共熔溶剂，芦丁萃取率较高（22.1 mg/g）。此外，大多数低共熔溶剂的芦丁萃取率均低于80 %甲醇的萃取率(14.9 mg/g)。溶剂的物理化学特性，如粘度、表面张力、物理吸附、化学相互作用、极性，均被视为影响萃取效率的因素。低共熔溶剂的粘度.比传统溶剂大2-3个数量级[11-13]。低共熔溶剂的粘度代表着形成氢键和范德华力的强度[12,15]。萃取介质的粘度可能通过影响传质控制增溶的能力。因此，低共熔溶剂的高粘度会降低萃取效率。 关于低共熔溶剂的选择，氯化胆碱-甘油.型的低共熔溶剂是萃取芦丁的最佳选择。然而氯化胆碱-甘油比甲醇的粘度高很多（大约320倍）。粘度的下降导致扩散系数的增加，从而提高了萃取效率。降低低共熔溶剂的粘度可以通过加水的方法。因此，当低共熔溶剂-水共溶剂体系作为萃取剂，萃取效率应该比纯低共熔溶剂更高。为证实这一假设，我们研究了氯化胆碱–水共溶剂体系萃取芦丁。图1 低共熔溶剂萃取芦丁得率（芦丁 mg/苦荞 g）。萃取条件：苦荞粉末40 mg，加入1 ml溶剂，40 ℃，1 h，超声功率200 W。与氯化胆碱-蔗糖相比，萃取率明显提高，以*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001表示。2.3 低共熔溶剂中水含量对芦丁萃取率的影响 之前，低共熔溶剂被认为是很有潜力的萃取天然产物的绿色溶剂[11,12,15]。然而，尽管低共熔溶剂有很大的潜力，但是其最大的一个缺点就是粘度大。不仅影响了传质，导致处理起来也很困难（例如在过滤、溶解以及澄清过程中）。除了氢键供体/氢键受.体摩尔比之外，水含量是影.响低共熔溶剂粘度.的另一个因素。氯化胆碱-甘油在不同含水量（w/w）的条件下（见表3），加入5.%的水时，粘度下降1/5，加入20.%的水时，粘度下降到原来的1/80。氯化胆碱-甘油随着水含量的增加粘度明显下降。此外，极性是低共熔溶剂的另一重要特性，因为极性影响增溶量。如表3所示，氯化胆碱-甘油的极性(ENR)随着水含量的增加而增加。这一结果表明，添加的水影响了氯化胆碱-甘油的极性。如上所述，氯化胆碱-甘油的物理性能和增溶能力，可以通过加入少量的水改性。在本研究中，对氯化胆碱-甘油-水混合物萃取芦丁进行了实验，水分数为0 % -50 %(w / w)。表3 不同含水量的氯化胆碱-甘油的极性以及粘度氯化胆碱-甘油水分含量(w/w)粘度(40 °C) a(Pa.s)ENRc(kcal/mol)03.1850.945%0.6350.6510%0.0649.9820%0.0449.7230%0.0349.2040%--b--50%----a检测剪切速率 0.268 [1/s]；b未检测到；cENR=hcNA/λmax 如图2所示，氯化胆碱-甘油中的水添加到适当的浓度后(<20 %, w/w)芦丁萃取率比较高。当含水量达到20 %（w/w）时，芦丁萃取率最高(35.2 mg/g)。水的加入导致反应介质粘度的降低，提高了从植物基质到溶液的传质，从而提高了萃取效率。然而，太多的水(> 30 %, w/w)在氯化胆碱-甘油中会导致萃取芦丁的得率下降。可能是因为芦丁在萃取媒介.中的溶解性降低，导致样品.和溶剂之间的相互作用减少。而且，过多的水稀释会导致氯化胆碱-甘油失去现有的氢键，因此，使得氯化胆碱-甘油的特殊结构消失。戴秉国等人[15]表明，当低共熔溶剂的含水量低于50.%时，低共熔溶剂的超分子结构得以保留。但是，进一步稀释会使个别成分溶解在水中。在稀释的过程中，低共熔溶剂结构的变化会影响其理化性质及其应用。一般来说，80 % (w/w)的氯化胆碱-甘油被认为是最佳的萃取剂以及后续实验的溶剂。图2 氯化胆碱-甘油含水量对于芦丁得率的影响。萃取条件：40 mg苦荞粉末，1 ml溶剂，40 ℃，1 h，超声辅助萃取功率200 W，萃取效率相比明显高于50%氯化胆碱-甘油，以*p<0.05, **p<0.01, 和***p<0.001表示。2.4 萃取方法的选择 超声辅助萃取由于其简便性而作为首选的萃取方法。基于以往的报告，涉及低共熔溶剂萃取两种常用的方法：搅拌以及搅拌加热。80 %(w/w)氯化胆碱-甘油作为萃取溶剂，在相同的条件下与超声辅助萃取相比见图3。如图3所示，芦丁的萃取效率取决于不同的萃取方法。超声萃取（条件：1 h，200 W，40 °C，样品/溶剂：40 mg/mL）所得芦丁的量是搅拌（条件：1 h，40 °C，250 rpm，样品/溶剂：40 mg/mL）的6.3倍，是搅拌加热（条件：1 h, 250 rpm, 65 °C, 样品/溶剂：40 mg/mL）的2.1倍。因此，比起搅拌以及搅拌加热，80%.氯化胆碱-甘油的超声辅助萃取方法，更适用于萃取芦丁。图3 使用80 %氯化胆碱-甘油时，比较.超声辅助萃取，搅拌以及搅拌加热方法。萃取效率.显著不同，由*p<0.01.和***p<0.001表示。 使用超声处理可以提高萃取过程中溶剂和植物基质之间的传质。这意味着，超声能在一定程度.上抵消低共熔溶剂高粘度对于萃取效果的影响。因此，超声和低共熔溶剂的结合具有提高萃取生物活性化合物效率的潜力。考虑到其较高的萃取率，因此选择超声辅助萃取，并进一步优化萃取条件，如下所述。2.4.1 温度 温度是一个主要影响因素，会影响低共熔溶剂的物理化学性质。高温与低粘度和表面张力有关[11-13]。如图4所示，直到温度达到60.℃，萃取的芦丁量一直都是在增加，然而在较高温度下，萃取的量并没有明显的增加或减少。因此，60 ℃是最合适的温度。图4 温度对芦丁萃取率的影响。萃取条件：40 mg苦荞粉末，1 ml 80 %氯化胆碱-甘油，30 min，200 W。2.4.2 萃取时间 超声辅助萃取从20 min进行到80 min，用于确定最佳时间。在图5中，超声萃取30 min 萃取量为36.5 mg/g，萃取率达到95 %。超声30分钟后，未观察到明显的增加。考虑到经济因素，30 min为最有效的萃取时间。图5 超声辅助萃取时间对于芦丁萃取率的影响。萃取条件：40 mg苦荞粉末，1 ml 80 %氯化胆碱-甘油，60 ℃，200 W。将超声辅助萃取和传统甲醇搅拌萃取进行比较，为了证明超声辅助萃取和低共熔溶剂的增效作用（详情见1.6，萃取芦丁）。实验结果表明，超声处理比起传统的甲醇，在60 ℃萃取相同的量(~36 mg/g)需要的时间为1/8甚至更少。这些结果表明，对于许多类型的天然化合物的萃取，低共熔溶剂可以作为绿色安全的溶剂，这取决于每个低共熔溶剂的物理化学性质。2.5 从低共熔溶剂中回收芦丁 在低共熔溶剂的研究中，由于低共熔溶剂不可忽略的蒸汽压，因此从萃取剂中回收萃取成分是相当具有挑战性的。已经发现有几种方法来回收已萃取的成分，包括超临界二氧化碳的使用，再结晶以及回收溶剂的应用。在本研究中，对从氯化胆碱-甘油中萃取的芦丁进行了回收。在0 ℃下加入20倍体积的水，静置4 h，结果水为最有效的回收溶剂，在所测试的溶剂中，回收率高达90.5 %。在萃取过程中使用低共熔溶剂的方法简单并且环保，尤其是它避免了生态破坏剂的使用和处理。2.6 纯化芦丁的结构测定回收之后，然后进一步分离纯化芦丁（详情见1.8，芦丁分离纯化过程）。芦丁产量为3.1±0.2 %（干基）。纯化产物的结构通过1H NMR 和13C NMR 谱表征（详情见1.9，纯化芦丁的结构测定）。正如预期，在产物的1H NMR谱中，氢分子发出了四个特征信号：12.61 ppm，10.82 ppm，9.65 ppm和 9.16 ppm，分别为5-OH质子，7-OH 质子，4-OH 质子和 3-OH 质子。在13C NMR谱中，27碳原子核很好分辨。133.2 ppm表明C-3连接糖基。3 结论 在本研究中，建立了一种使用低共熔溶剂快速，绿色且有效的方法，用于苦荞中芦丁的萃取。超声的应用与传统固-液方法比较，提高了萃取过程中的效率。低共熔溶剂的使用代替了甲醇等有毒试剂的使用，并且在其他研究中，提供了一个更加“绿色”的过程。从低共熔溶剂中回收萃取的芦丁，用回收溶剂非常有效。这一过程简单并且萃取率高。目前的研究实例显示出，低共熔溶剂作为一个设计的溶剂，能够有选择性的，有效的从生物中萃取生物活性成分。致谢在论文完成期间，同时还得到了黄瑶师姐，乔颖师姐在实验操作、论文撰写等方面对我的关心和帮助，在此同表谢意！此外，也感谢学校及院里的领导为我们提供了良好的学习氛围和实验环境，让我得以为大学四年的学习生涯画上一个圆满的句号。最后，感谢我的家人一直以来对我的无私奉献和鼎立支持，使我能顺利的完成学业，我定不辜负他们的期望！ 参考文献：[1]黄艳菲,彭镰心,李艳丹等.高效液相色谱法测定荞麦不同种、植株不同部位芦丁的含量[J]. 食品安全与检测, 2012, 37(12): 274-283[2] S.J. Kim, I.S.M. Zaidul, T. Maeda, T. Suzuki, N. Hashimoto, S. Takigawa, T. Noda, C. Matsuura-Endo, H. Yamauchi, A time-course study of flavonoids in the sprouts of tartary (Fagopyrum tataricum Gaertn.) buckwheats[J]. Sci. Hortic, 2007,115:13–18.[3] I. Choi, H. Seog, Y. Park, Y. Kim, H. Choi, Suppressive effects of germinated buckwheat on development of fatty liver in mice fed with high-fat diet[J]. Phytomedicine, 2007, 14: 563–567.[4] D. Zielinska, D. Szawara-Nowak, A.Ornatowska,W. Wiczkowski, Use of cyclic voltammetry, photochemiluminescence, and spectrophotometric methods for the measurement of the antioxidant capacity of buckwheat sprouts[J]. J. Agric. Food Chem, 2007, 55: 9891–9898.[5] Z.L. Zhang, M.L. Zhou, Y. Tang, F.L. Li, Y.X. Tang, J.R. Shao, W.T. Xue, Y.M. Wu. Bioactive compounds in functional buckwheat food[J]. Food Res. Int, 2012, 49: 389–395.[6] N. Fabjan, J. Rode, I.J. Kosir, Z. Wang, Z. Zhang, I. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1□材料与方法2
1.1□试剂 2
1.2□主要仪器设备2
1.3□标准曲线的制备2
1.4□制备低共熔溶剂2
1.5□芦丁在不同溶剂中的溶解性3
1.6□萃取芦丁3
1.7□高效液相色谱法测定芦丁含量3
1.8□芦丁分离纯化过程3
1.9□纯化芦丁的结构测定3
1.10□数据分析 4
2□分析与讨论4
2.1□初始萃取条件的选择4
2.2□低共熔溶剂对芦丁萃取效率的影响4
2.3□低共熔溶剂中水含量对芦丁萃取率的影响5
2.4□萃取方法的选择6
2.4.1□温度7
2.4.2□萃取时间7
2.5□从低共熔溶剂中回收芦丁8
2.6□纯化芦丁的结构测定8
3□结论8
致谢8
参考文献8
新型绿色萃取剂在食品功能成分萃取中的应用研究
引言
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spkxygc/45747.html
