目 录
目 录 I
1 引言 1
1.1 海蚬的特性 1
1.2 海蚬多糖及其化学修饰的研究现状 2
1.3 研究过程中的注意点 3
1.4 本课题研究的背景及意义 4
2 实验材料和方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 研究方法 5
3 结果与分析 8
3.1 DEAE-纤维素柱层析法 8
3.2 乙酰化修饰分析 8
3.3 体外抗氧化活性 13
结 论 16
致 谢 17
参 考 文 献 18
1 引言
随着对海洋生物资源的进一步开发和对糖类药物研究的日益重视，海洋动物多糖的研究与开发越来越受到国内外学者的广泛关注[1]。近年来，研究发现淡水贝类多糖如河蚌、田螺、河蚬等多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化，增强机体免疫能力等生物活性，其结构也同样复杂, 组成品种繁多[2]。海洋贝类资源的高效利用和深度开发是我国经济贝类养殖业可持续发展的重要研究方向，其中贝类多糖在功能性保健食品和创新药物的研究与开发方面具有良好的应用前景。本实验以海蚬为原料，对海蚬粗多糖进行提取制备、分离纯化，并对多糖进行化学修饰，研究其生物活性。
1.1 海蚬的特性
1.1.1 海蚬简介
海蚬俗称青蛤、铁蛤、蛤蜊，学名Cyclina sinensis，属软体动物门、帘蛤纲、帘蛤科、青蛤属。海蚬贝壳近圆形，壳面极凸出，宽度较大；壳顶突出，尖端弯向前方，无小月面，盾面狭长；韧带黄褐色，不突出壳面；生长纹明显，无放射肋；贝壳内边缘具整齐的小齿，稀而大；左右两壳各具主齿3枚。海蚬主 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
要分布在我国南北沿海与河口沿岸的潮间带，多生活在近高潮区和中潮区的泥沙滩涂中[3]。
1.1.2 海蚬的营养价值
海蚬营养成分分析表明，软体中含有丰富的糖类、蛋白质（肽）等成分，含有亮氨酸、蛋氨酸等10多种人体必需的氨基酸，还含有酪氨酸和胱氨酸等非必需氨基酸，不饱和脂肪酸含量大大高于饱和脂肪酸，EPA和DHA的含量较高。因此，海蚬以其肉味鲜美、营养丰富、蛋白质含量高等诸多优点，逐渐成为人们喜爱的海产品[4]。
1.1.3 海蚬多糖的生物活性
（1）抗氧化活性
郭雷等[4]通过还原力、总抗氧化力、对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除活性评价了脱蛋白海蚬多糖的体外抗氧化活性，结果显示海蚬多糖具有较强的抗氧化活性，且活性呈现浓度依赖性。
（2）抗肿瘤活性
目前从海洋生物中提取多糖并测定其抗肿瘤活性的文献已有大量报道，但是有关青蛤活性多糖的抗肿瘤活性研究很少。胡聪聪等[5]研究发现，在最佳工艺条件下提取的多糖经体外抗肿瘤实验表明，该糖具有显著的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞的半数抑制率约为4.6mg/mL，且多糖浓度与增长抑制率呈量效关系。
（3）抗病毒活性
病毒必须吸附于人体敏感细胞才能起始感染，贝类多糖能与病毒或宿主细胞的受体结合，从而阻断病毒对宿主细胞的吸附，防止结合细胞的形成，而达到抗病毒的作用。Woo 等从文蛤中分离的多糖能阻碍爱滋病毒(HIV)对T细胞的粘附和融合从而发挥抗HIV活性[6]。
（4）提高免疫力
贝类多糖能激活机体的非特异性免疫和特异性免疫系统，从而增强机体的免疫功能。大量研究表明多糖的抗肿瘤作用主要是通过免疫途径实现的[7]。
1.2 海蚬多糖及其化学修饰的研究现状
1.2.1 海蚬多糖的研究现状
随着多糖的进一步开发和海洋药物的广泛应用，关于海洋生物多糖的研究也日益增多[8]。目前，关于贝类多糖的提取工艺、分离纯化、理化性质、单糖组成、结构特征、生物活性等方面研究均有报道，而关于海蚬多糖的研究鲜有报道。多种贝类多糖的研究，为海蚬多糖的研究提供了基础。2010年，胡聪聪等[5]对海蚬多糖提取的条件优化及其抗肿瘤活性进行了研究，并发表文章。2011年，蒋长兴老师对海蚬多糖的分离鉴定、硫酸酯化及其生物活性进行了深入研究，为之后的学者对海蚬多糖的研究提供了可行性方案。2014年，郭雷等[4]对海蚬多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性进行了研究，为海蚬多糖的进一步研究和产业化开发提供参考。2014年，蒋长兴[9]老师等再次对海蚬多糖的结构表征、硫酸酯化和抗肿瘤活性进行研究，证实了海蚬多糖的组分特征及硫酸酯化多糖的抗肿瘤活性。现在，贝类多糖的提取、成分测定和生物活性已成为生物研究中的一大热门。
1.2.2 多糖化学修饰的研究现状
近年来，对多糖结构进行适当修饰已成为多糖领域研究的重点之一。多糖生物活性的发挥与其结构有关，通过利用糖链上的羧基、羟基、氨基等基团进行化学方法修
饰引入其他基团，能够提高多糖的活性。常用的多糖结构修饰的方法有硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等[10]。
（1）硫酸化修饰
自Nakashima等人对某多糖的抗病毒复制作用进行了相关报道了以来，硫酸化多糖因其抗病毒活性得到了人们的广泛关注。硫酸多糖是一类糖基上带有硫酸基团的多糖，目前已有很多研究表明了多糖的硫酸化修饰可以增强其化学活性。硫酸化方法的原理为：溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在一定的条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团。多糖硫酸化修饰常用的方法有氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、氨基磺酸-甲酰胺法及三氧化硫-二甲基甲酰胺法等，前3种应用较多。
（2）磷酸化修饰
多糖的磷酸化修饰是一种对分子支链的共价修饰，经磷酸化修饰后的多糖衍生物其抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等生物活性得到明显提高。目前有关多糖磷酸化的研究报道相对较少，磷酸基团是如何在多糖残基上发挥作用的机理尚不明确，所以还有待进一步的研究[11]。常用的磷酸化试剂有磷酰氯、磷酸酐、磷酸或其盐。
（3）乙酰化修饰
乙酰化修饰是多糖结构修饰中重要的支链修饰方法之一。多糖经乙酰化修饰后，由于其羟基暴露在外，从而增加了多糖在水中的溶解度，因此更利于活性的发挥。研究表明，乙酰化多糖乙酰基的数量和取代位置与多糖的活性也存在一定的构效关系。其中O-3位被乙酰基取代时，多糖的抗肿瘤活性明显增强；O-5位被乙酰基取代时，其抗肿瘤活性显著减弱；O位全部被乙酰基取代时，则多糖的活性完全消失。其原因可能是乙酰基的引入通过改变了多糖糖链分子的空间排布，从而使之活性也相应发生改变。因此，如何采取适当的方法在特定的位置引入乙酰基，从而发挥所需功效是以后需要深入研究的方向之一[11]。
（4）烷基化修饰
多糖的烷基化分子修饰是指向主链的还原末端引入长链芳香醇，解决多糖粘度高、溶解度低而不利于活性的发挥等问题。烷基化反应后的多糖分子的水溶性增大，从而使其原有的活性增加。在自然界中壳聚糖含量较高，所以对其研究较为广泛。对壳聚糖进行烷基化，目前研究比较多[10]。在碱性条件下对其进行烷基化，可以增强其
水溶性等。
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2.2 研究方法

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