摘要：由于抗生素在人医临床以及畜牧业中的滥用，抗生素耐药性的广泛传播如今已成为一个严峻的全球性问题。耐药基因在人类环境及野生环境中广泛存在，其来源、功能、生态行为有待进一步探究。本课题利用宏基因组学功能筛选的方法在珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中挖掘新型的四环素耐药基因，从已筛选的约120万文库菌中筛选到8个具有四环素低敏感性的阳性单克隆。再经最低抑菌浓度（MIC）检测，确定其中3株为高耐药克隆，5为敏感克隆。并将阳性克隆提取质粒，以备进行基因测序从而探究耐药基因的功能与结构。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1 抗生素配制 4
1.2.2 培养基配制4
1.2.3 文库二代菌的制备4
1.2.4 表型筛选4
1.2.5 阳性克隆鉴定及保菌5
1.2.6 确定阳性克隆的MIC5
1.2.7 质粒提取5
2 结果与分析 6
2.1 阳性克隆筛选6
2.2 MIC 6
2.3 阳性克隆质粒测序 7
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
图1 MIC结果示意图7
表1 四环素MIC判定界值及质控范围6
表2 阳性克隆MIC测定结果 7
利用宏基因组学方法挖掘新型四环素耐药基因的研究
引言
自四十年代以来，抗生素对控制人类及动物感染性疾病发挥了巨大的作用。然而随着抗生素在人医临床以及农业，尤其是畜牧业中的滥用，细菌耐药性的大范围爆发如今已成为一个严峻的全球性问题。与此同时，耐药菌及耐药基因在各种环境介质包括食物链中迅速扩散，已成为食品安全与公共健康的重要威胁。世界卫生组织（WHO）已将抗生素耐药基因列入21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一，并宣布将在全球范围内对控制耐药基因进行战略部署。然而，各种“超级细菌”以及新型耐药机制的不断涌现暴露了我
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们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。
过去很长时间内，人们认为耐药性是细菌针对特定抗生素产生的特异性现象，然而近年来的研究发现这一过程远没有如此简单。D’Costa等人在三万年以上的永久冻土层中发现了β内酰胺类、四环素类以及糖肽类抗生素的耐药基因，说明这些耐药基因的存在远远早于这些抗生素被人类使用的时间。并且在这一冻土层中发现的古老的糖肽类耐药基因vanA与现代临床菌中发现的vanA基因结构和功能都相似 [1]。事实上，大部分临床病原菌携带的耐药基因其实均起源于自然环境。目前被广泛使用的大多数抗生素都是由土壤微生物产生的，它们将抗生素作为武器彼此竞争生存所需的资源，而这些抗生素生产菌必然携带耐药基因以保护自身。并且这些抗生素生产菌往往表现为多重耐药，说明它们可能可以生产不止一种抗生素，或者是为了抵抗周围其它菌的竞争。例如在天蓝色链霉菌中发现一种蛋白，其编码基因从序列到作用方式均类似于人病原菌的一种万古霉素耐药基因，但是天蓝色链霉菌本身却并不生产糖肽类抗生素 [2]。此外，还有一些耐药基因的原始功能可能并不是介导耐药性，而是参与到其他信号传输和细胞代谢过程中。如β内酰胺酶，由于它们的结构与青霉素结合蛋白（PBPs）类似，它们的原始功能可能就是作为PBPs参与肽聚糖的合成，而对β内酰胺类抗生素的水解作用可能只是它们的“副作用” [3]。环境中所有这些具有直接或间接耐药作用的基因被称为环境耐药基因组。
基因的水平转移是耐药性传播的重要环节。通过移动元件（包括质粒、转座子以及整合子）的接合转移以及噬菌体转导，耐药基因得以在细菌间，甚至是不同生态系统中迁移传播。耐药基因耐药基因在临床细菌间的水平转移已有很深入的研究 [4, 5]。而自然环境中的土著细菌拥有与临床菌相同的移动遗传元件，并且有些环境菌与临床菌的种系非常接近，使得耐药基因在环境菌与临床菌间的传播成为可能。溯源研究发现致病菌中广泛分布的质粒携带的超广谱β内酰胺酶CTXM基因起源于环境中的克吕沃尔菌属 [6]。在临床鲍氏不动杆菌中发现的可介导其获得blaOXA23基因而导致多重耐药表型的插入性序列ISAba1和ISAba2，同样也广泛存在于土壤中一类低GC含量的质粒上，这类质粒包含多个不动杆菌的遗传标记，并且拷贝数很高[7] [8]。尽管目前研究十分有限，但这些发现已充分证明了在环境菌及临床菌之间发生耐药基因水平转移的可能性。土壤中具有极复杂的微生物多样性，使得庞大的土壤耐药基因组成为最大的耐药基因储藏库。
目前对于环境耐药基因组的研究才刚刚开始。土壤微生物蕴藏着大量未开发的资源，经粗略估算，1克土壤中可包含约580种不同的放线菌，所包含的遗传物质容量可生产11600种生物活性小分子 [9]。然而传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物，99%的微生物为非培养性微生物。这极大的限制了人类对土壤微生物遗传资源的有效利用 [10]。而宏基因组学技术的出现，使人们对不可培养微生物的研究成为了现实。宏基因组学（metagenomics）最初由Handelsman等 [11]于1998年提出，是以生态环境中全部微小生物的基因组作为研究对象，绕过传统微生物分离培养过程，通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选，寻找和发现新的功能基因的一种方法 [12]。宏基因组学让我们的研究对象从单个微生物基因组扩大到整个群体中所有个体的基因组。
细菌抗生素耐药性在全世界范围内的爆发暴露了我们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。耐药菌及耐药基因的扩散已严重威胁生态环境及人类健康。我们一方面需要开发更多有效的抗菌药物，另一方面需要更深入地理解抗生素耐药性的发生与发展过程。今后的研究重点将不再局限于临床菌株耐药性及动物源性食品抗生素残留的监控，而在于从生态学的角度更深入的理解耐药基因的生态学功能，包括其来源、分布、作用机理、迁移扩散机制，以及对生态环境和人类健康构成的威胁。
新的宏基因组学方法以及分子生物学和遗传学技术（如高通量测序技术）的发展为最大限度挖掘土壤中庞大的未开发的耐药基因组资源提供了可能。我国拥有丰富的土壤环境和特色土壤生态系统的微生物类群，蕴含着特殊生理、生态效应的新物种和相应的天然产物资源，然而我国宏基因组学相关研究起步较晚，利用宏基因组学方法发掘耐药基因组的研究尚属空白。本实验以四环素耐药基因为目标，利用宏基因组学功能筛选的方法在已有的珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中挖掘新型耐药基因，为下一步研究环境中耐药基因的生态学功能和迁移传播机制打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株来源

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