摘要：建立一套适合桃果实蛋白质组学研究的双向电泳体系，为桃果实蛋白质组学的后续研究奠定基础。以霞晖8号桃果实为实验材料，分别比较了不同蛋白提取方法，不同上样量以及不同pH范围IPG胶条对2-DE图谱的影响。 结果表明，采用TCA-丙酮结合酚抽法提取桃果实线粒体中的蛋白质，采用IPG胶条pH5-8、蛋白质的上样量为1200μg、考马斯亮蓝G-250胶体考染法进行染色。在此条件下进行桃果实线粒体蛋白的双向电泳可获得重复性好、 分辨率高的双向电泳图谱。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.1.3 仪器2
1.2 线粒体的分离和纯化 2
1.3 线粒体蛋白的提取及含量的测定 2
1.3.1 苯酚/醋酸铵甲醇法2
1.3.2 TCA/丙酮沉淀法2
1.3.3 线粒体蛋白测定3
1.4 双向电泳3
1.5 染色方法4
1.6 凝胶扫描与图像分析4
2 结果与分析4
2.1 不同染色方法对2DE效果的影响4
2.2 不同提取方法对蛋白质产量和2DE效果的影响4
2.3 第一向等电聚焦pH范围对2DE效果的影响4
2.4 蛋白质上样量对2DE 效果的影响4
3 讨论 5
3.1 染色方法5
3.2 蛋白质提取方法5
3.3 IPG胶条pH范围6
3.4 上样量的选择6
4 结语7
致谢7
参考文献7
桃果实线粒体蛋白双向电泳体系的建立
引言
引言
蛋白质组（Proteome）是一个基因组所表达的全部蛋白质，即生物物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液等在特定的环境条件、特定的时刻全部蛋白质表达的图谱[1]。如今，蛋白质组学已经开始应用于植物亚细胞器领域，尤其是线粒体细胞器
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
，重点研究细胞器蛋白的相互作用，以及不同样品细胞器蛋白的表达差异、蛋白修饰等[2]。
双向电泳技术（Twodimensional electrophoresis,2DE）作为蛋白质组学三大关键核心技术之一，是目前惟一能同时将上千种蛋白质分离和展示的方法，也是分析复杂组分蛋白质分辨率最高的工具[3]。由于植物中蛋白质含量相对较低，且含有如色素、淀粉、多糖、多酚、单宁和有机酸类等大量干扰性物质，给植物蛋白质组学研究增加了困难，因而双向电泳技术在植物中的应用早期主要集中于拟南芥[4]、水稻[5]、小麦[6]、玉米[7]等传统模式作物。近年来，随着蛋白质提取技术的改进，双向电泳技术在桃[8]、草莓[9]、柑橘[10]、西红柿[11] 、生菜[12] 、发菜[13]等水果蔬菜中的应用逐渐增多。研究桃果采后品质劣变过程中的蛋白质组学，对从分子层面深入揭示桃果品质劣变机制具有重要意义。
本实验以桃果为研究对象，通过比较不同蛋白质提取方法，不同上样量及不同pH范围IPG胶条对2DE图谱的影响，以期探索出一种适合桃果实线粒体蛋白质组分析的方法，为进一步开展桃果差异蛋白质组学的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 材料 实验采用的水蜜桃果实（品种：霞晖8号）于2014年8月采自江苏省农科院桃园，采后充分散去田间热后，选择果形整齐、大小均匀一致、无病虫害、无机械损伤且成熟度一致的果实迅速用液氮冷冻，保存于 70 ℃ 冰箱备用。
1．1．2 试剂 乙二醇双（2氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、固化pH梯度干胶条（IPG）、两性电解质（BioLyte）、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Arc）、N，N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔点琼脂糖（LMP）、考马斯亮蓝G250等：购自美国BioRad公司；三氯乙酸（TCA）、丙酮、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、甘氨酸（Glycine）、β巯基乙醇（βMe）、十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、矿物油、过硫酸铵（Aps）、四甲基乙二胺（TEMED）、Tris平衡酚、牛血清蛋白（BSA）等：均为国产分析纯。
1．1．3 仪器 高速冷冻离心机：GL20GⅡ，上海安亭科学仪器厂；微量高速冷冻离心机：美国FRESCO 17 Thermo电子公司；等电聚焦仪：Protean IEF System ，美国BioRad公司；高重复性高通量大型垂直电泳槽：EttanDALTTwelveGE061TY7119GEHealthcare，美国BioRad公司；ImageScannerⅢ扫描仪（28907607GEHealthcare美国）。
1．2 线粒体的分离和纯化
参照Qin等[14]的方法稍加修正，是匀浆磨碎细胞。然后进行差速离心和密度梯度离心，差速离心包括低速去除大分子杂质、高速沉淀线粒体，进行线粒体的分离。先将匀浆液在3000g下离心15min，取上清，然后在14000g下离心30min，取沉淀部分，得到粗提后的线粒体。将线粒体用重悬液重悬，进行密度梯度离心。密度梯度离心的介质用percoll细胞分离液，分别用8%、28%、40%三个浓度梯度，80000g离心1h，进行线粒体的纯化，纯化后的线粒体会停留在28%和40%的分阶层。收集28%和40%分解层的线粒体，用洗涤液洗涤，去掉percoll，18000g离心20min，收集线粒体沉淀。
1．3 线粒体蛋白的提取及含量的测定
1．3．1 苯酚/醋酸铵甲醇法 参照Zhang等[15]方法用酚抽法提取线粒体蛋白，将提取后的线粒体用线粒体裂解裂解2h，加入2倍体积的Tris平衡酚，提取蛋白2h，14000g离心，收集酚相。加入4倍的丙酮，20℃静置过夜，沉淀蛋白。10000个离心30min，分别用预冷的甲醇和丙酮各洗蛋白两次。4℃干燥，挥发丙酮。20℃保存备用。
1．3．2 TCA/ 丙酮沉淀法 根据Wang等[16]方法并加以改进：将样品用液氮在研钵中研磨成粉。然后分别加入 20mL20℃预冷的体积分数10% TCA/ 丙酮、0.1 mol/L 乙酸铵甲醇、体积分数80%丙酮清洗并沉淀，并于10 000 g离心30 min，去掉上清，收集沉淀，最后置于4℃下干燥。向干燥好沉淀中按先后顺序加入2倍体积pH为7.8 Tris平衡酚及SDS混合液（体积比为1∶1），充分振荡，混匀，10000 g，4 ℃下离心30 min，上层为酚相，中间白色物质为杂质，下层为水相。回收酚相，加入3倍体积预冷丙酮，充分混匀，20℃下过夜培养，沉淀蛋白。沉淀分别用预冷的甲醇和体积分数80%丙酮冲洗1次，4℃下干燥后置于20℃保存备用。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spzlyaq/44442.html