摘要：单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的食源性致病菌，可引起李斯特菌病，感染严重者会出现致死现象。本文针对食品中出现最多的单增李斯特菌1/2a血清型，应用基因组学和生物信息学方法挖掘特异性靶点基因片段，以LMOf2365_2721和LMOSLCC5850_0078为检测靶点基因，设计两对特异性引物Lm8和m2a4，建立单增李斯特菌1/2a血清型的多重PCR检测方法，该方法检出限为305.5 fg/μL和8.6×103 cfu/mL，单增李斯特菌1/2a血清型菌株在与其它血清型菌株共同培养过程中没有干扰反应体系，增菌10~12 h即可检测出单增李斯特菌初始污染浓度为8.6×101~ 8.6×100 cfu/10 mL的牛奶样品。这表明该多重PCR法对单增李斯特菌1/2a血清型的检测和鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 实验菌株2
1.1.2 主要试剂及培养基3
1.1.3主要仪器设备 3
1.2 方法 3
1.2.1 提取基因组DNA及纯度分析 3
1.2.2 单增李斯特菌1/2a血清型引物的设计和筛选 4
1.2.3 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR检测体系的建立和优化5
1.2.4 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的特异性评价5
1.2.5 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的灵敏度评价5
1.2.6单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的抗干扰性评价5
1.2.7单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的人工污染实验 5
2 结果与分析6
2.1 单增李斯特菌1/2a血清型引物的筛选6
2.2 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR反应体系的优化7
2.2.1 dNTP Mixture添加量的优化 7
2.2.2 MgCl2
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添加量的优化7
2.2.3 Taq酶添加量的优化 7
2.2.4 退火温度的优化8
2.2.5 循环次数的优化8
2.3 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的特异性评价 8
2.4 单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的灵敏度评价 9
2.5单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的抗干扰性评价10
2.6单增李斯特菌1/2a血清型多重PCR方法的人工污染实验10
3 讨论11
致谢 12
参考文献 12
单增李斯特菌血清型特异性引物的筛选与检测方法的建立
引言
单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是李斯特菌属中对人类和动物危害最大的致病菌。1891年法国学者Hayen最早在人体组织中观察到该菌，1940年Pirie将之命名为L.monocytogenes [1]。孕妇感染单增李斯特菌容易出现流产、早产，甚至会导致胎儿死亡；免疫力低下人群感染后则出现发热性胃肠炎、败血症、脑膜炎等严重的侵袭性病症；免疫力正常个体症状较为轻微，主要表现为腹泻、发热、呕吐[2]。感染该菌后，婴幼儿、老年人及免疫低下病人临床死亡率为20~30%[3]，死亡率较高，因此该菌已经成为一种重要的食源性致病菌。上世纪八十年代以来，世界各地关于单增李斯特菌感染案例的报道日渐增多，流行病学调查结果表明这些感染病例主要是由被污染的食品引起的[4]。除食品外，单增李斯特菌还在自然环境以及牛奶等食品加工环境中广泛存在。因此，在食品保藏与流通过程中需要对其进行实时监控[5]。
单增李斯特菌共有13个血清型，大部分人类感染主要由4b、1/2a和1/2b 这三种血清型菌株引起[6]，其中最常见的是1/2a血清型[7]。单增李斯特菌血清型的传统鉴定方法是检测分离培养后的可疑菌落的生化反应、典型运动等特征，被确定的李斯特菌再进行血清型分析。但是生理生化鉴定容易受到多种因素的干扰，如污染食品的单增李斯特菌含量、背景菌株的存在以及在食品加工过程中单增李斯特菌的活性情况[8]。所以在检验之前，需要对样品进行增菌，这使得检测过程变得繁琐，且检测时间增长。因此，建立快速简便且特异灵敏的单增李斯特菌血清型检测方法对于食品安全具有着重要的意义。
随着生物信息学的发展，利用生物信息技术和比较基因组的方法挖掘单增李斯特菌血清型的特异性靶标，正得到越来越多的应用。以这些特异性基因为检测靶点，利用PCR等分子生物学技术可以直接鉴定出单增李斯特菌血清型。郑华英等[9]通过多重PCR扩增Lmo0737、Lmo1118、ORF2819和ORF21104个目标基因，建立了能够检测出单增李斯特菌1 /2a 和1 /2b血清型的检测方法，通过验证，多重PCR血清分型结果与血清学分型结果完全相符合，由此可见多重PCR血清分型方法使得单增李斯特菌血清分型更为容易。本研究以食品中分布最多的单增李斯特菌1/2a血清型为研究对象，应用基因组学和生物信息学方法挖掘和筛选特异性靶点基因片段，设计特异性引物，建立了针对单增李斯特菌1/2a血清型的多重PCR检测方法，并对其特异性、灵敏度以及人工污染样品检测能力进行了评价。这为单增李斯特菌感染的控制和诊断、李斯特菌病流行病学调查提供了可靠的技术手段。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌株
本实验所涉及到的菌株包括36株单增李斯特菌分属13个不同血清型和24株非单增李斯特菌。其中的标准菌株分别购买于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）、中国医学细菌保藏管理中心（CMCC），其它菌株为大学食品科技学院酶工程实验室保藏菌株（见表1）。
表1 菌株及其编号
菌株
编号
血清型
菌株
编号
单增李斯特菌
CICCa 21662
英诺克李斯特菌
CICC 10416
单增李斯特菌
CICC 21632
英诺克李斯特菌
CICC 10417
单增李斯特菌
CICC 21633
伊氏李斯特菌
CICC 21663
单增李斯特菌
CICC 21634
格氏李斯特菌
CICC 21670
单增李斯特菌
CICC 21635
斯氏李斯特菌
CICC 21671
单增李斯特菌

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