沙门氏菌在食品加工器械接触表面上形成的生物菌膜是造成食品交叉污染主要的途径之一，研究已表明ArcZ、InvR、OmrA及OxyS四种非编码小RNA（Non-coding smallRNA，sRNA）可显著促进沙门氏菌生物菌膜的形成。本研究在ArcZ、InvR、OmrA及OxyS四种非编码小RNA对肠炎沙门氏菌粘附性能的影响的基础上，继续探究该四种sRNA对肠炎沙门氏菌三种移动性能—— swimming（游泳）、 swarming（群泳）和twitching（蹭行）的影响和生物菌膜的粘附规律与菌体表面移动特性之间的关系，并通过Mueller-Hinton琼脂纸片扩散法使用11种抗生素对其进行耐药性测试。结果表明四种sRNA缺失菌株的swimming与swarming性能显著高于野生型肠炎沙门氏菌，而突变株的twitching性能却明显弱于野生株。在抗生素敏感性上，野生株和突变株都只对氨苄西林产生抗性，多重抗生素抗性（MAR，Multiple Antibiotic Resistance）指数都为0.09。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试剂和设备 2
1.2.1培养基和主要试剂2
1.2.2主要仪器设备3
1.3试验方法3
1.3.1菌株的活化3
1.3.2菌体移动性能3
1.3.3抗生素敏感性试验3
1.3.4统计分析4
2结果与分析4
2.1四种非编码小RNA对沙门氏菌移动性能的影响结果4
2.1.1 Swimming测定4
2.1.2 Swarming测定5
2.1.3 Twitching测定5
2.2四种非编码小RNA对沙门氏菌抗菌素耐药性能的影响结果6
3讨论6
3.1非编码小RNA对菌体移动性能的影响 6
3.2非编码小RNA对沙门氏菌抗菌素耐药性能的影响7
致谢8
参考文献8
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RNA对沙门氏菌移动性能和耐药性能的影响
引言
沙门氏菌作为影响范围最广的生物致病因子之一，其每年引发的食品安全事件不计其数，这对人体健康与食品生产加工企业造成了极大的危害。据USCDC和EUEFSA统计，沙门氏菌已成为影响公众健康的首要食源性致病菌[12]。根据中国食源性疾病监测网的调查结果显示，食品加工设备与器械等表面造成的交叉污染是最主要的食品污染途径，约占27%[3]，其主要来自于器械设备接触面上存在的粘附菌体[4]。作为食源性致病菌的主要代表之一，沙门氏菌通常以生物菌膜的形式粘附并生长于食品加工器械表面，生物菌膜是沙门氏菌自身增殖及其胞外分泌物而形成的具有一定空间结构的细菌聚集体[5]。对于外源消毒剂和清洁剂，生物菌膜具有非常强的耐受性[6]，其分泌的胞外物质对杀菌剂有一定的抵抗作用，从而使其难以渗透生物菌膜内部[7]。目前多起食源性致病菌食物中毒事件的溯源结果显示，食品加工接触表面形成的生物菌膜是食品污染的原始祸源。
菌体自身特性与环境因素可对生物菌膜的形成产生重要影响，且影响结果往往都是多重因素交叉作用共同所致，较为复杂。Nilsson等[8]研究发现不同分离源（环境源、动物源、医源、食源等）致病菌粘附性能差异显著，DíezGarcía [9]与Marin等[10]的研究也表明血清型是菌株生物菌膜形成能力的关键因素。菌体的培养环境对生物菌膜形成的影响极为复杂，不同环境因子如温度、pH、营养基质、含氧量、离子种类与强度等的组合对菌体菌膜形成量的影响也是众多学者的研究方向。此外，菌体生长接触的材质表面的电荷特性也会影响生物菌膜的粘附效果，研究表明菌体在疏水表面的粘附能力强于其在亲水性表面[11]；菌体表面特性如疏水性、菌体的聚集性能、得失电子能力和移动能力等对生物菌膜形成可产生重要影响[12]，比如移动性能强的菌株粘附性能强于移动性能弱的菌株[13]。
总结国内外的研究现状，可发现其研究方法与技术主要集中在不同菌株分离株与菌株血清型以及各种应激条件对生物菌膜的形成、侵袭性能、微观结构及胞外分泌物的影响等方面。当前，随着细菌基因测序技术的不断发展，人们在原核生物中发现了一类新的调控因子——非编码小RNA（Noncoding small RNA，sRNA），长度为50~500 nt[14]，在基因组中被转录但不翻译编码功能蛋白质。研究表明，菌体的sRNA对细菌在恶劣环境下的生长[15]以及在细菌生物菌膜的形成[16]起着重要的调控作用。此外，sRNA与相关靶基因的作用可以调控革兰氏阴性菌与宿主相互作用的过程中外膜蛋白的表达[17]，因此sRNA与细菌的粘附、生长、毒力侵袭、耐药性等特性均密切相关。
尽管引发食品安全事件的沙门氏菌血清型种类众多，但肠炎沙门氏菌是最主要的血清型种类，所以本研究以肠炎沙门氏菌为研究对象。实验室前期通过转录组学技术构建了肠炎沙门氏菌的四种特征性 sRNA 缺失突变菌株ArcZ、InvR、OmrA与OxyS，并探究了sRNA对生物菌膜形成能力和胞外聚合物（extracellular polymer，EPS）组分构成的影响[18]，但在菌体其它功能特性、功能基因表达规律以及 sRNA 的时序性表达规律等方面上还没进行相关后续研究，所以本试验将在前人研究的基础上，对野生株及突变株在菌体的表面移动特性与耐药性能进行深入探讨，以在分子层面上全面揭示 sRNA对菌体表面特性与耐药性能的调控作用，完善特征性sRNA的调控网络；重点分析菌体表面移动特性与生物菌膜的粘附规律之间的关系，有助于从转录水平上阐明生物菌膜的形成机理，完善其科学理论体系，并在食品工业上为制定沙门氏菌的工业化控制措施提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 试验材料
野生型肠炎沙门氏菌（61）分离自肉鸡胴体屠宰加工器械接触表面；四种特征性 sRNA 缺失突变型肠炎沙门氏菌（ArcZ、InvR、OmrA、OxyS）由国家肉品质量安全控制工程技术研究中心提供。
1．2 试剂和设备
1．2．1 培养基和主要试剂
木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD，Xylose Lysine Desoxycholate Agar）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，Trypticase Soy Broth）、LB肉汤（LB Broth）、MuellerHinton琼脂（MuellerHinton Agar）、胰蛋白胨 （Tryptone）、琼脂粉（Agar Powder）、均购于青岛高科园海博生物技术有限公司。

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