群体感应系统(Quorum sensing, QS)是影响细菌特定基因表达，调控微生物生理特征的重要结构。目前，研究已经发现在铜绿假单胞菌中包含多个群体感应系统，但是对这些系统的活力缺乏比较，且异源重构的机制尚不清晰。本研究选取了lasi、lasb、hcna这三个受铜绿假单胞菌QS调控的基因，构建了基于这3个基因的群体感应系统，其相关元件包括分别对应的启动子Plasi、Plasb、Phcna，信号分子LasI以及受体蛋白LasR。将这些元件构建到工程菌中进行表达，通过在各自启动子的下游添加荧光蛋白基因EGFP，观察荧光强度来对系统活力进行判断，从而找出这三套系统中活力最强的系统。所以本研究的意义在于为以后构建无需诱导剂诱导，可以进行自主调控的基因开关提供良好的研究基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1前言2
2材料与方法3
2.1实验材料3
2.1.1菌株和质粒3 2.1.2细菌培养基及培养条件3
2.1.3实验试剂 3
2.1.4实验仪器 3
2.2实验方法 3
2.2.1提基因组3
2.2.2 PCR扩增4
2.2.3电泳4
2.2.4胶回收4
2.2.5电泳验证5
2.2.6加A5
2.2.7 TA克隆 5
2.2.8转化至大肠杆菌JM1095
2.2.9菌落PCR5
2.2.11转化至大肠杆菌BL21进行表达6
2.2.12定性定量分析6
3结果与分析6
3.1群体感应系统的构建6
3.1.1铜绿假单胞菌QS受体蛋白基因与信号分子基因的克隆及表达载体构建7
3.1.2 PlasI、PlasB、Phcna启动子表达元件的构建7
3.1.3群体感应系统的组装9
3.2荧光显微镜观察定性分析9
3.3酶标仪测量定量分析10
3.3.1时间影响荧光强度10
3.3.2系统完整性影响荧光强度10 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 

3.3.3不同启动子影响荧光强度10
4总结与展望11
致谢11
参考文献12
一种来源于铜绿假单胞杆菌的群体感应系统的异源重构
引言
1 前言
铜绿假单胞杆菌是一种适应性很强的革兰氏阴性菌，它能够在环境中广泛的生长。之所以它能够广泛的分布于自然界之中，是因为它拥有多种代谢途径，可以利用多种有机化合物合成所需的能源。它的耐药性和毒力都十分强，想要对它进行治疗十分困难，革兰氏阴性菌的致病机理与其细胞壁组成息息相关，主要是有由其中的脂多糖造成的，脂多糖在人体之中会激发人体的一种自身免疫反应的产生。而且由于脂多糖一般存在于革兰氏阴性菌的细胞壁之内，这就导致大多数抗生素无法对其造成的感染进行有效抑制且抗生素治疗有一定的缺陷，就是细菌会产生耐药性，且耐药性会逐年上升[1]，所以我们亟需找到一种新的治疗方式来对它进行治疗。
群体感应系统最初是在20世纪70年代，由Nealson以及Hastings通过研究费氏弧菌生物发光现象而得到的，一开始，人们并不知道它是群体感应系统，只是发现费氏弧菌在发光时产生了菌群间的交流和相互作用。到了90年代Greenburg正式将这种在微生物小群体间的调控作用命名为群体感应[2]。群体感应机制广泛存在于病原菌中，与侵染过程与毒力因子的表达有着密切联系[35]。细菌可通过可扩散的小分子信号分子来感知细胞群体的密度，等到细胞群体达到阈值后，相关信号分子也积攒到一定浓度，从而引起一些特定基因在细菌群体中的协调表达，也可以对微生物群体的生理特征进行调控，比如说为了适应环境的变化，在生物发光，生物膜的形成等方面进行调节，可以使细菌能够更好地应对恶劣的环境。
目前，群体感应系统主要的研究方向是对病原菌的检测以及防治。有研究利用呋喃酮类与AHL进行竞争，抑制群体感应系统的启动，从而干扰细菌生物被膜的形成影响致病因子的表达；也有研究将病原菌的群体感应系统作为靶标，直接对病原菌进行定点消灭。
研究已经发现在铜绿假单胞菌中拥有多个群体感应系统，但是对这些系统的活力缺乏比较，且异源重构的机制尚不清晰。在这些系统之中含有两套主要的群体感应系统[6]，分别是LasI/LasR系统以及RhlI/RhlR系统，它们之间独立但又相互关联[7]，均依赖于AHL作为信号分子。lasi基因负责控制3OC12HSL(PAI1)信号分子的合成，当AI的浓度达到一定的阈值时，信号分子会与受体蛋白相结合到靶位点启动并控制基因的表达[8]。如果缺失LasR多聚物，铜绿假单胞菌将不能正常产生毒性，对生物造成损害[9]。RhlI/RhlR系统与LasI/LasR系统的区别在于RhlI/RhlR系统的自诱导分子为C4HSL，它也可以激活部分基因的表达。这两个系统之间存在级联调控机制[10]，当浓度达到阈值，LasI/LasR系统位于系统的顶层最先被启动大量释放信号分子LasI，在此过程中对RhlI/RhlR系统进行正向调控，因此想要完全激活RhlI/RhlR系统就必须要获得完整且具有活力的LasI/LasR系统[11]。
综上所述，最终选择对LasI/LasR系统进行研究构建。我们克隆基于铜绿假单胞菌lasi的群体感应系统的启动子Plasi、信号分子LasI以及受体蛋白LasR；基于铜绿假单胞菌lasb的群体感应系统的启动子Plasb、信号分子LasI以及受体蛋白LasR；基于铜绿假单胞菌hcna的群体感应系统的启动子phcna、信号分子LasI以及受体蛋白LasR，并将这三组系统各自的元件分别构建到工程菌中进行表达。通过荧光显微镜观察进行定性分析判定系统是否具有活性，通过酶标仪测量荧光强度，筛选出具有高活力的群体感应系统。之所以能够通过显示荧光强弱来判断群体感应系统的活力，是因为通常群体感应系统的正常运转是通过信号分子与受体蛋白相结合，浓度达到一定的阈值，从而激活启动子开始下游基因的表达。将启动子的下游基因替换成荧光蛋白基因EGFP，系统能够产生荧光，就证明异源重构的系统可以正常的进行表达，并且我们可以通过测量荧光强度来对系统的活力进行比较。

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