交替糖蔗糖酶（alternansucrase）是葡聚糖蔗糖酶中的一种，该酶耐热性较强，易于在常温下提取和保存，也具有较高的商业价值。交替糖是一种非典型的葡聚糖，它是一种新型的功能性乳酸菌胞外多糖，它具有一些特殊的功能特性，如抗热性强、抗酸性强、抗微生物降解性强等等。本实验利用柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）1.2461发酵产生交替糖蔗糖酶，并且从发酵液中提取出较纯的交替糖蔗糖酶，并且对其酶学性质和产糖能力等进行研究
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论1
1 材料与方法 2
1．1实验材料及仪器 2
1．1．1主要材料及试剂 2
1．1．2主要设备及仪器 2
1．2实验方法 2
1．2．1交替糖蔗糖酶的分布研究 2
1.2.1.1菌种发酵 2
1.2.1.2可溶性蛋白的测定：考马斯亮蓝G250法 3
1.2.1.3酶活的分布 3
1.2.1.4交替糖蔗糖酶存在于细胞内外的研究 3
1．2．2交替糖蔗糖酶的提取与制备 3
1.2.2.1交替糖蔗糖酶的粗酶液的提取 3
1.2.2.2交替糖蔗糖酶的纯化 3
1.2.2.2.1聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀 4
1.2.2.2.2 DEAE52离子层析柱纯化 4
1.2.2.2.3 SDSPAGE电泳蛋白纯度检测 4
1.2.3交替糖蔗糖酶的酶学性质分析 5
1.2.3.1酶活测定方法 5
1.2.3.2还原糖（果糖）的测定：3，5二硝基水杨酸（DNS）法 6
1.2.3.3温度对酶活的影响 6
1.2.3.4酶的热稳定性的研究 6
1.2.3.5 pH对酶活的影响 6
1.2.3.6酶的酸碱稳定性的研究 6
1.2.3.7金属离子对酶活的影响 7
1.2.4交替糖的提取与检测 7
1.2.4.1交替糖的提取 7< *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
br /> 1.2.4.2交替糖的检测与鉴定：高效液相色谱法 7
1.2.5交替糖蔗糖酶产交替糖的研究 7
1.2.5.1多糖含量的测定：硫酸苯酚法 7
1.2.5.2加酶量对交替糖产量的影响 7
1.2.5.3温度对交替糖产量的影响 7
1.2.5.4 pH对交替糖产量的影响 7
1.2.5.5蔗糖添加量对交替糖产量的影响 8
1.2.5.6反应时间对交替糖产量的影响 8
2 结果与分析 8
2．1 各部分酶活、蛋白含量的分析与研究 8
2．1．1 交替糖蔗糖酶存在于细胞内外的研究 8
2．1．2提取过程中各部分的酶活和蛋白量 8
2．2 交替糖蔗糖酶的纯化结果 9
2．2．1不同浓度PEG6000沉淀后的酶活 9
2．2．2离子层析柱DEAE52洗脱 10
2．2．3 SDSPAGE电泳蛋白纯度检测 11
2．3酶学性质的研究 11
2．3．1温度对酶活的影响 11
2．3．2交替糖蔗糖酶的热稳定性 12
2．3．3pH对酶活的影响 12
2．3．4交替糖蔗糖酶在各种pH下的稳定性 13
2．3．5金属离子对酶活的影响 13
2．4酶法合成交替糖的研究 13
2．3．6交替糖蔗糖酶所产糖的HPLC检测图 13
2．4．1加酶量对产交替糖量的影响 14
2．4．2温度对产交替糖量的影响 14
2．4．3 pH对产交替糖量的影响 15
2．4．4蔗糖含量对产交替糖量的影响 16
2．4．5最适温度（40℃）下反应时间和交替糖产量的关系 16
3 结论 17
致谢 17
附录 标准曲线19
柠檬明串珠菌产交替糖及交替糖蔗糖酶的研究
引言
葡聚糖蔗糖酶是一种α转糖苷酶，它能以蔗糖为唯一底物在没有其他物质参与反应的条件下生成α葡聚糖，当有可识别的外源受体存在时，也能将葡糖基转移给外源受体，经过糖基化反应而生产出各种糖基化产物。葡聚糖蔗糖酶因为其反应特殊性、反应产物多样性以及其对产物合成的操作性之强而成为了被外界广泛用于生物催化合成的一种酶类。在饲料、食品、医药等工业领域有着广泛的应用前景。
现如今，人们已经开始越来越关注自身健康与日常饮食方式以及饮食习惯，而越来越多的企业与生产商家已经开始致力于开发能调节人体内微生物组成的产品，从而改善人们的身体健康状况，其中有许多也已经体现了交替糖蔗糖酶的实用价值，社会各界也开始更多的注意到交替糖蔗糖酶的存在和重要性。交替糖蔗糖酶在食品方面的应用主要体现在2个方面：能够生成乳酸菌胞外多糖和低聚糖。乳酸菌胞外多糖在食品生产方面具有远大的应用前景，主要是由于其两方面的特性——理化特性和生理功能，例如益生元、降低血压、降低胆固醇含量、降低人体血糖等。我们平时所能接触到的焙烤产品、饮料等食品中都不乏乳酸菌胞外多糖的身影存在，作为良好的食品添加剂，它能够帮助食品改善食品本身的一些缺陷，例如质构、流变性、粘弹性、稳定性、持水性和口感等[13]。由于当今大多数消费者更喜爱粘稠顺滑的纯天然发酵牛奶制品，所以此特点在发酵乳制品生产工业中的重要性尤为突出，因为利用这一特点，生产企业能够在满足消费者少甚至无添加剂、低糖、低脂饮食需求的同时，兼顾消费者对于众多牛奶制品中固形物含量或粘稠度的需求，同时还能改善乳制品的风味和口感等特点。另外，有些消费者喜爱更加有弹性的酸奶产品，而当在酸奶中加入杂多糖时，后者所携带的阴离子会和酸奶中酪蛋白所携带的阳离子发生作用从而达到消费者的需求。此外，乳酸菌胞外多糖通常携带大量的羟基，可以使酸奶制品拥有很好的保水性，锁住水分防止产品缩水，同时也保持了产品良好的外观。同时，某些有着益生元特性的低聚糖[13]，如低聚半乳糖、低聚果糖等，在食品中都已经被广泛使用，并且现在有许多企业和生产商都致力于开发更多的新型益生元产品，同时也有很多研究人员利用这葡聚糖蔗糖酶的转糖基作用，以蔗糖等廉价物质为底物，去合成具有高价值的有益生元特性的低聚糖。Gregory等[45]研究发现，交替糖蔗糖酶以蔗糖为底物发生受体反应所得到的的低聚糖，能够非常高效地帮助人体控制肠道中细菌病原体的生长，既可以促进肠道有益菌的繁殖发育，也可以有效的遏制致病性大肠杆菌、沙门氏菌、荚膜梭菌的生长。Marial[6]对以蔗糖和麦芽糖为底物的交替糖蔗糖酶的受体反应产物，进行了益生元特性的研究。研究发现，受体反应产物中DP4糖拥有很好的益生元特性，甚至高于目前被广泛使用的低聚果糖的益生元特性指数。本实验通过将柠檬明串珠菌发酵过程中在细胞膜和细胞壁上所产生的交替糖蔗糖酶用尿素[7]提取后分别通过聚乙二醇6000、DEAE52离子层析柱、透析等方法进行进一步的分离纯化，通过SDSPAGE电泳检测提取物蛋白纯度。本文又通过改变温度、pH等条件研究了该种酶的最适保存环境，通过改变合成交替糖的条件优化了体外酶法合成交替糖的方案。

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