基于生物量的杏鲍菇菌株筛选及其深层发酵培养条件的优化
摘 要
本文以杏鲍菇的液体深层发酵生物量（菌丝体干重，DCW）为观测指标，对7株产区杏鲍菇菌种进行了筛选，确定“东张柱状杏鲍菇”为实验菌株。研究了营养因子和发酵条件对实验菌株菌丝体生物量的影响，优化了发酵培养基和发酵条件。通过单因素实验和四因素三水平正交实验确定最佳的杏鲍菇液体深层发酵培养基配方；在此基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，对发酵过程中影响杏鲍菇菌丝体生长的三个关键因素（温度、转速和发酵周期）进行优化，通过求解回归方程、响应面分析和验证实验，确定杏鲍菇深层液体发酵最佳条件。结果表明，优化后的发酵培养基组分为：葡萄糖3.5g/100mL，胰蛋白胨0.5g/100mL，磷酸二氢钾0.35g/100mL，硫酸镁0.20g/100mL，pH自然。且在杏鲍菇菌丝体发酵温度25℃，摇床转速160r/min，发酵周期7.3d（即175.2h）条件下，杏鲍菇菌丝体生物量（菌丝体干重）可达1.125g/100mL。
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关键字:杏鲍菇菌株筛选深层发酵正交实验响应面分析
目 录
1 引言 1
1.1 杏鲍菇的营养及药用价值 1
1.2 杏鲍菇深层液体发酵培养条件优化研究状况 1
1.3 本研究的意义 1
2材料与方法 2
2.1 材料 3
2.1.1 实验菌种 3
2.1.2 培养基 3
2.1.3 其他材料 4
2.1.4 主要试剂 4
2.1.5 主要仪器设备 4
2.2 试验方法 5
2.2.1 实验程序路线图 5
2.2.2 杏鲍菇拮抗实验 5
2.2.3一级摇瓶菌种的制备 6
2.2.4 杏鲍菇优势菌株筛选 6
2.2.5 发酵培养基最佳碳源和氮源筛选试验 6
2.2.6 最佳碳源、氮源、无机盐单因素试验 6
2.2.7 正交设计试验 7
2.2.8 杏鲍菇菌丝体发酵条件单因素试验 7
2.2.9 Box-Behnken的中心组合试验设计及响应面分析 7
2.2.10 测定方法 8
3 结果与分析 9
3.1 杏鲍菇菌种间拮抗结果 9
3.2 杏鲍菇菌丝体发酵优势菌株筛选试验结果 10
3.3 杏鲍菇菌丝体发酵培养基最佳碳源和氮源筛选试验结果 10
3.3.1 不同碳源对杏鲍菇菌丝体深层发酵的影响 10
3.3.2 不同氮源对杏鲍菇菌丝体深层发酵的影响 11
3.4 最佳碳源、氮源、无机盐单因素试验结果 12
3.4.1 碳源质量百分比浓度对杏鲍菇菌丝体深层发酵的影响 12
3.4.2 氮源质量百分比浓度对杏鲍菇菌丝体深层发酵的影响 12
3.4.3 无机盐质量百分比浓度对杏鲍菇菌丝体深层发酵的影响 13
3.5正交设计实验结果 14
3.5.1 直观及极差分析 14
3.5.2 方差分析 15
3.6 杏鲍菇菌丝体发酵条件（发酵周期）单因素试验结果 16
3.7 响应面优化分析 19
3.7.1 响应面设计及结果 19
4 结论与展望 20
参考文献 27
致谢 28
1 引言
杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，属担子菌纲（Basidiomycota）、伞菌目（Agaricales）、侧耳科（Pleurotaceae）、侧耳属（Pleurotus）[1]，是适合食用菌工厂化栽培的主要品种之一。杏鲍菇形似鲍鱼，并以此得名；菌肉肥厚，质地脆嫩，口感绝佳；蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、镁、锌、铜等矿物质含量丰富[2,3]，市场前景广阔。
1.1 杏鲍菇的营养及药用价值
杏鲍菇是一种富含营养的食用菌新品。有研究指出，杏鲍菇中富含的生理活性物质可以在一定程度上提高人体免疫功能；同时，杏鲍菇脂肪含量低，对人体具有抗癌、降血脂、促进胃肠消化、防止心血管病等功效[4,5]，因此，杏鲍菇可以说是一种非常珍贵的食用菌新品种，市场需求量逐年增加[6]。
在世界范围内，杏鲍菇主要分布于南欧、北非、中亚许多国家。而就国内来说，四川(九寨沟、长海草地)、青海、新疆也发现杏鲍菇踪迹[7,8]。近几年来，我国的杏鲍菇栽培规模不断扩大。但由于生产栽培过程中对环境条件和栽培技术要求比较高，由于技术环节把握不好，通常难以达到高产优质[9,10]。
1.2 杏鲍菇深层液体发酵培养条件优化研究状况
自从1948年美国H.Humfeld首先提出并成功地采用液体培养法培养双孢菇菌丝体以来[11]，利用液体深层发酵技术培养食、药用菌就引发了人们的重视。食用菌液体深层发酵具有工艺简便、菌种更纯、周期更短、成本更低、污染更少、操作更简便等一系列优点[12]，使固体菌种生产中的一些常见问题得到，是未来食用菌菌种的主要研究方向[13]。
目前，关于杏鲍菇液体菌种的研究报道比较少，所做研究中大部分都是停留在实验室阶段[14,15]。要想在短时间内提高杏鲍菇产量，就必须确定其发酵最佳培养基配方及发酵条件，以得到最大的杏鲍菇菌丝体生物量，为进一步的工厂化生产打下基础。
在本实验中，运用正交试验设计确定最佳培养及配方，并采用极差分析、响应面分析[16,17]等处理数据，确定杏鲍菇的最佳发酵条件，从而获得杏鲍菇液体发酵的最优工艺，并使实验结果更加全面，可信度即实际应用价值得到提高。
1.3 本研究的意义
目前，杏鲍菇栽培工艺主要采用固体菌种技术，这种技术通常有季节和原材料的约束，同时生产周期长、成本较高且容易污染。实践证明，通过食用菌深层液体发酵工艺制备的液体菌种可替代固体菌种用于栽培生产，相对于固体菌种技术，液体菌种具有上面提及的很多优势，因此，对杏鲍菇深层液体发酵技术的研究具有广阔的应用前景。
本研究针对上述讨论的问题，基于当前几种主要的工业生产菌种，以生物量为基准，筛选出产量高、生长速度快的菌株。先通过最适碳氮源实验确定杏鲍菇液体发酵的最佳碳、氮源，再通过单因素试验确定培养基内四种主要营养组分最适用量，然后再对这四种主要的营养分子进行四因素三水平的正交试验，从而得到杏鲍菇液体发酵的最佳培养及配方。最后采用响应面分析法对杏鲍菇液体培养条件进行优化，旨在缩短发酵周期，得到杏鲍菇最高产量。为杏鲍菇的工厂化生产打下基础，提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验菌种
表1 杏鲍菇菌株编号
Tab.1 Numbers of Pleurotus eryngii strains
编号 杏鲍菇菌种
A 东张保龄球状杏鲍菇
B 正兴柱状杏鲍菇
C 河北杏鲍菇
D 正兴保龄球状杏鲍菇
E 东张柱状杏鲍菇
F 脱毒杏鲍菇
G 杏鲍菇1号
实验用斜面菌种由食用菌工程技术实验室转接，保藏。
2.1.2 培养基
（1）综合PDA培养基
马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，VB1 0.0002%
（2）一级摇瓶培养基（L）
黄豆粉60g，葡萄糖30g，胰蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，VB1 10mg
（3）菌种筛选液体培养基（L）
葡萄糖20g，胰蛋白胨3g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，VB1 1mg，pH自然
（4）碳源供试培养基 （L）
胰蛋白胨3g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，碳源20g（葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉），VB1 10mg，pH自然；
（5）氮源供试培养基（L）
葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，氮源3g（牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾），VB1 10mg，pH自然。
2.1.3 其他材料
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spzlyaq/5963.html
