橡栗蛋白提取及流变性质研究[20200408174251]
摘 要
本实验以橡栗为原料，采用传统的碱溶酸沉法提取橡栗蛋白，利用紫外、荧光及流变等方法对橡栗蛋白的结构和功能进行了分析。紫外吸收光谱表明橡栗蛋白在218nm和280nm附近有两个明显的吸收峰。荧光光谱说明pH环境可影响橡栗蛋白质构象。综合橡栗蛋白提取得率，证明pH7.0为最佳提取条件。粘度分析显示橡栗蛋白溶液表现出假塑性流体的特征，随着剪切速率的增加，橡栗蛋白溶液的粘度迅速下降；频率及温度扫描表明钙离子浓度的增加可促进橡栗蛋白凝胶的形成。
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关键字:橡栗蛋白流变性质钙离子
目 录
前言 1
1 材料与方法 1
1.1 实验材料 1
1.1.1 原料 1
1.1.2 主要试剂 1
1.1.3 主要仪器 2
1.2 实验方法 2
1.2.1橡栗蛋白的提取 2
1.2.2 三种不同pH下提取的橡栗蛋白的紫外吸收光谱测定 2
1.2.3三种不同PH下提取的橡栗蛋白的荧光光谱测定 2
1.2.4 流变学性质的测定 2
2 结果与讨论 3
2.1不同pH条件下提取的橡栗蛋白的得率 3
2.2紫外吸收光谱分析 3
2.3荧光光谱分析 5
2.4 流变学性质的分析 7
2.4.1 粘度的分析 7
2.4.2 频率扫描 10
2.4.3凝胶性能 12
3 结论 18
4 展望 19
5 参考文献 20
致谢 21
前言
橡栗又叫黄栗，它和我们平时吃的板栗属于同一科目，是乔木植物橡栗树的种子，它们广泛分布于桐城西北部各山中。它是栎树的果实，长圆形，外壳可制烤胶，果肉可以酿酒。橡栗也叫橡实、橡子、橡果。橡栗属于坚果类，但它不像其他的坚果如核桃、杏仁等含有大量的油脂，它的淀粉含量非常高，可酿酒或制豆腐、粉丝等[9]。也可入药，有和胃补中的作用，也可以治疗拉肚子。橡栗粉富含多种对人体有益的营养成分：脂肪、淀粉、蛋白质、单宁、钙、钾、钠、镁、铁、硒等元素一应俱全。橡栗中的维生素B1、B2含量丰富，比水果更胜一筹，所以橡栗实用前景非常广阔，对橡栗的研究也是及其有必要的。
本实验研究的是橡栗中的蛋白质。橡栗虽然在现代生活中出现的很少，但是这种野生的食物将来一定会成为很好的馈赠佳品，中国的美食在世界上都是佼佼者，现在橡栗已经被生产成橡栗粉橡栗粉丝作为地方特产了，且药用价值相当高，以后一定会有越来越多的研究。中国对橡栗的研究还处于起步，通过研究橡栗中的蛋白自可以更好的了解橡栗更好的利用橡栗，虽然橡栗中的蛋白质含量远远不如其他食物，但是橡栗中蛋白质的研究还是很有必要性的。
本研究将通过碱提酸沉法提取出橡栗中的蛋白质[8]，确定最佳的提取方案。根据紫外吸收光谱和荧光光谱对其结构进行分析，确定橡栗蛋白的蛋白质结构。为了研究钙离子对蛋白质流变性的影响，用流变仪测定不同钙含量下蛋白质的粘度、频率及凝胶性能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料
橡栗 产地江苏常熟
1.1.2 主要试剂
试剂 厂商
乙醇（95%） 江苏强顺化工有限公司
氢氧化钠 江苏强顺化工有限公司
盐酸 江苏强顺化工有限公司
磷酸二氢钾 江苏强顺化工有限公司
磷酸氢二钠 江苏强顺化工有限公司
硫酸钙 江苏强顺化工有限公司
1.1.3 主要仪器
仪器 厂商
pH计 METTLER TOLEDO
TG16-WS 台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司
EL104电子分析天平 METTLER TOLEDO
TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司
Physica MCR301型流变仪 Anton Paar GmbH
1.2 实验方法
1.2.1橡栗蛋白的提取
橡栗 → 去壳 → 晒干 → 粉碎 → 加水 →三等分→调pH值3.0、7.0、10.0 → 分别低速搅拌2h → 分别离心分离(3000×g，20 min) → 上清液 → 都调pH为4.5 → 分别离心分离(3000×g，20 min) → 沉淀即为橡栗蛋白。
1.2.2 三种不同pH下提取的橡栗蛋白的紫外吸收光谱测定
将三种不同pH下提取的橡栗蛋白溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配制成1.0mg/mL的溶液，以pH7.0的磷酸缓冲液作参比，采用UV-2450紫外可见分光光度计作紫外－可见扫描，速度1.0nm/s，范围200-800nm之间。
1.2.3三种不同PH下提取的橡栗蛋白的荧光光谱测定
参照Kalapathy等人的方法，将橡栗蛋白分别溶于pH6.5、7.0和8.0的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L）中，配制成2.0 mg/mL的蛋白质溶液，以对应不同pH的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液作参比，采用RF-5301PC型荧光分光光度计进行荧光测定。发射光谱：激发波长固定在280 nm，扫描范围300-800 nm；激发光谱：发射波长固定在335 nm，扫描范围220-400 nm。
1.2.4 流变学性质的测定
取一定量橡栗蛋白（pH7.0条件下提取的）样品，分别溶解在0.1 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为8%的溶液。
（1） 粘度测定[11]
用上述溶液在Physica MCR301型流变仪进行振荡分析，平板半径50 mm，间距1 mm，加样量0.9 mL，剪切速率0.1-200 1/s。在加样前将较低板的温度调至25.0℃。
通过滴加硫酸钙，分别将钙含量调至0 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L，按照以上参数设置与加样方法测出钙含量不同的蛋白质的粘度。
（2） 频率扫描
使用Physica MCR301型流变仪进行振荡分析，平板半径50 mm，间距1 mm，加样量0.9 mL。在下列应力模式下进行频率扫描：自动应力，初始应力0.8 Pa，目标应变0.5%。扫描频率范围在0.1-100 rad/s之间。在加样前将较低板的温度调至25.0℃。
通过滴加硫酸钙，分别将钙离子浓度调至0 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L，按照设置好的参数和设计好的方法测出钙含量不同的频率扫描。
（3） 凝胶性能
使用Physica MCR301型流变仪进行小变形凝胶性能分析，平板半径50 mm（使用溶剂盖），间距1 mm，加样量0.9 mL。固定角频率10 rad/s，应变0.5%。程序升温：25℃-95℃，程序降温：95℃-25℃，速率：10℃/min。在加样前将较低板的温度调至25.0℃。
通过滴加硫酸钙，分别将钙含量调至0 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L，按照以上参数设置与加样方法测出钙含量不同的凝胶性能。
2 结果与讨论
2.1不同pH条件下提取的橡栗蛋白的得率
根据公式：
式中：M———橡栗蛋白的质量，g;
W———橡栗的质量，g。
三种不同pH条件下提取的橡栗蛋白，pH7.0条件下提取的橡栗蛋白得率为3.8%，pH10.0条件下的得率为1.3%，pH3.0条件下的得率为0.2%，得出pH7.0为橡栗蛋白的最佳提取条件。
2.2紫外吸收光谱分析
紫外吸收光谱是通过测定不同物质的吸收峰来定量分析物质的结构特性，对于同一物质，不论浓度是否相同，其最大吸收峰对应的波长相同，曲线的形状也相同，蛋白质有自己特定的形状，这就可以确定我们所测物质是否为蛋白质。

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