河蚬抗氧化肽的响应面法优化制备及活性评价
摘 要
目的：应用响应面实验设计优化河蚬肉制备抗氧化肽的最佳酶解工艺条件，并进行体外抗氧化比较。方法：以单因素（料液比、pH、加酶量、酶解温度和酶解时间）实验为基础，羟自由基(hydroxyl free radical, ·OH)清除率为评判指标，根据响应面中的Box-Behnken试验设计原理，通过响应面分析得到抗氧化肽的最佳酶解条件，再与Vc、BHT 进行体外抗氧化的进一步比较。结果：在料液比为1：3，温度为54.70℃，pH为6.00，酶解时间为3.91h，加入中性蛋白酶的量为0.94%（以河蚬肉计）的条件下测得羟自由基清除率为83.34%。，验证值79.63%。结论：该响应面设计实验可以很好的预测中性蛋白酶酶解河蚬液制备抗氧化肽的酶解工艺条件，而且酶解出的河蚬抗氧化肽体外抗氧化能力相对来说弱于等浓度（13.53mg/mL）的VC，而与等浓度（13.53mg/mL）的BHT近似。
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关键字:河蚬响应面抗氧化肽羟自由基
目 录
1 引言 1
1.1 河蚬价值及加工现状 1
1.2抗氧化肽的国内外的研究现状以及研究目的和意义 1
2实验材料及仪器设备 3
2.1 实验材料 3
2.2 主要试剂 3
2.3 主要设备 3
3 实验方法 4
3.1 实验方法设计 4
3.1.1原料的简单处理 4
3.1.2 单因素探究实验 4
3.1.3 响应面分析法 5
3.2 测定方法 5
3.2.1羟自由基清除率的测定方法 5
3.2.2 肽得率的测定方法 6
3.2.3清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH）能力的测定方法 6
4实验结果与分析 7
4.1单因素试验结果 7
4.1.1酶种类的筛选实验验结果 7
4.1.2 料液比对羟自由基清除率的影响 8
4.1.3 pH对羟自由基清除率的影响 8
4.1.4加酶量对羟自由基清除率的影响 9
4.1.5酶解温度对羟自由基清除率的影响 10
4.1.6酶解时间对羟自由基清除率的影响 10
4.2 响应面试验结果及分析 11
4.3 响应面验证实验 19
5体外抗氧化模型试验比较 20
5.1羟自由基清除能力的比较 20
5.2清除二苯代苦味肼基自由基能力的比较 20
5.3清除超氧阴离子自由基能力的比较 21
6 结论及展望 22
参考文献 24
致 谢 25
1 引言
1.1 河蚬价值及加工现状
河蚬( Corbicula fluminea )是双壳类软体动物，属于瓣鳃纲、真瓣鳃目、蚬科、蚬属，主要分布于中国，朝鲜，日本和东南亚各国，是我国重要的经济贝类之一。河蚬外壳呈黄绿色或棕黄色，有的呈黑褐色，河蚬不仅营养丰富（富含优质蛋白，脂肪含量较低），而且味道鲜美，内脏也可同食，故人体可以很容易吸收其所含有的钙、铁和碘等元素[1]。目前，河蚬资源的利用率较低，仅局限在生鲜食用，或制成蚬干、咸蚬和罐头等粗加工方面，表现出的附加值低。而对于河蚬提取物的研究仅仅只限制在多糖跟多肽片段的初步阶段[2]，并且至今还未能获得多糖以及多肽片段提取的最优方案。因此，本次尝试使用响应面法来优化河蚬抗氧化肽提取的工艺。
江苏省养殖河蚬的历史悠久，特别是我省的太湖、洪泽湖、骆马湖等河蚬天然资源丰富，为我省特有物种，因产自湖中无污染深水区域及捕捞的季节不同，河蚬壳如金黄色，所以也有“黄金蚬”之称。目前，河蚬资源一方面主要以鲜销为主，或附加销售一些粗加工的产品，另一方面是将蚬肉经过速冻后出口给日本、韩国和东南亚一些国家。据相关资料报导，我国将鲜活的河蚬以每吨1000元的价格出口，而韩国人经过深加工后可卖到12.08万元，其附加值被增值了120多倍[3]。另外，河蚬初加工中形成的河蚬汤汁在韩国进行深加工后卖出了比食用油还贵的价钱。因此，我省河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的物质来源。
1.2抗氧化肽的国内外的研究现状以及研究目的和意义
我国的水产品加工厂数不胜数， 而加工所残留的大量低值水产品（蛋白资源）下脚料大多都被废弃，资源都得不到充分利用，开发水产的抗氧化肽既充分利用了废弃资源，又会为社会创造一定的资源财富。
现今研究表明，大部分可食用的鱼贝类都有其独特的鲜味，当对该食品进行水提，再进行浓缩时，可得到水溶性提取物，其主要成分就是该类食品的呈味成分。国内外的研究已从众多的食物蛋白酶水解液中分离出具有一定抗氧化性的肽片段[4]，而且海洋、水产鱼类和贝类是获得该生物活性肽的主要来源之一。其中国内的毋瑾超等人[5]研究表明:以贻贝等水产蛋白为原料可酶解出具有高ACE抑制活性的多肽，该活性肽具有显著的降血压作用。而邱春江，陈瑜等人[6]对贻贝酶解物进行羟自由基测定，得出在最优条件下，羟自由基清除率可达76.15%，而且活性肽的分子量为1.4kDa，国外的Se-Kwon等学者也从鳕鱼皮酶解液中分离出了一小段具有抗氧化性的氨基酸残基片段；Chen等[7]通过酶法水解制备了抗氧化性多肽，并表明这类多肽能螯合金属离子，捕捉自由基，从而起到抗氧化作用；Suetsuna K．等[8]也从某蛋白酶解物中分离得到了抗氧化肽。而且国内研究表明从扇贝中提取的水溶性扇贝多肽，相对分子质量大约为800—1000 Da[9]，它清除皮肤中超氧负离子的效率非常的高(3％和15％的肽片段对超氧负离子的清除率分别为11．7％和41．8％)。同时其抗皮肤衰老的效果非常明显(使用该肽片段后，表皮组织中的成纤维细胞厚度明显增加)。因现今对于贝类（河蚬）抗氧化肽的分离纯化的鉴定指标还少见报道[10]，因此本实验通过响应面法对单因面影响因素实验结果的测定进行比较分析，旨在为进一步分离纯化河蚬中抗氧化肽的提取提供理论依据。
正如上文所述，抗氧化肽能快速地清除人体内的氧自由基[11]，以此来保护细胞以及线粒体的正常结构和功能[12]，而且还可以防止食品变质（防止脂质过氧化反应），因此抗氧化肽在生物制药和食品防腐方面具有很广泛的应用前景。但水产抗氧化肽的研究技术还不是够成熟的：第一、目前涌现出很多测定抗氧化能力的方法，但是能够作为标准测定方法的很少，使得测得的实验结果不具有可比性，因此需统一抗氧化能力测定的标准；第二、水产抗氧化肽具体结构以及功能协同作用有待进一步研究；第三、有关生物抗氧化肽的活性研究大部分是体外抗氧化实验[13]，而未真正深入到机体内的研究；第四、对于抗氧化肽提取工艺的产品损失未计入得率中[14]；第五、在抗氧化肽分离纯化的研究实验中，一些钠盐钾盐等盐类的存在会影响抗氧化肽的活性，而在测定时并未考虑排除这些盐类的影响；第六、目前的分离纯化技术很难纯化得到分子量很小的氨基酸组成的肽段，这也就是大部分研究报道所纯化得到的抗氧化肽分子量大小都大于500 Da的原因之一。[15]
2实验材料及仪器设备
2.1 实验材料
速冻河蚬肉(江苏省宿迁楠景水产品有限公司) 、碱性蛋白酶（NOVO分装，CAS:9014-01-1 ACT:200000u/g EXP:08/2014 上海奥宇生物科技有限公司）、中性蛋白酶（NOVO分装，CAS:9068-59-1 ACT:200000u/g EXP:11/2014 上海奥宇生物科技有限公司）、木瓜蛋白酶（NOVO分装，CAS:9014-03-4 ACT:800000u/g EXP:09/2014 上海奥宇生物科技有限公司）、复合风味蛋白酶（NOVO分装，ACT:15000u/g EXP:08/2014 上海奥宇生物科技有限公司）、菠萝蛋白酶（NOVO分装，CAS:9001-00-7 ACT:600000u/g EXP:10/2014 上海奥宇生物科技有限公司）。
2.2 主要试剂
甲醛、草酸钾、氢氧化钠、邻二氮菲、DPPH、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氨丁三醇、维生素C、BHT、五水合硫酸铜、邻苯三酚、结晶牛血清蛋白、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、乙醇（以上均为分析纯）。
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spzlyaq/5984.html
