荷叶黄酮超声微波辅助提取工艺及其抗氧化活性
摘 要
以荷叶为原料，采用超声-微波辅助提取技术，以荷叶黄酮得率为指标，探讨液料比、微波功率和提取时间对荷叶黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上，通过响应面Box-Behnken中心组合法对超声-微波辅助提取荷叶最佳工艺条件进行优化。通过荷叶黄酮对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除作用探讨其抗氧化活性。结果表明，荷叶黄酮超声-微波辅助提取工艺为：微波功率 66 W，料液比 1:50(g/mL) ，提取时间为11.5 min。荷叶黄酮对羟基自由基（•OH）和超氧阴离子（O2-）有较明显的清除作用，其清除率与黄酮浓度有一定的量效关系。
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关键字:荷叶黄酮超声-微波响应面抗氧化
目 录
1 前言 1
1.1 荷叶概述 1
1.2 黄酮类化合物的主要提取方法 1
1.2.1 水提法 1
1.2.2 醇提法 1
1.2.3 超声波法 1
1.2.4 微波法 2
1.2.5 其他方法 2
1.3 研究意义 2
2 材料与方法 3
2.1 材料与设备 3
2.2.1 材料 3
2.2.2 设备 3
2.2 实验方法 3
2.2.1 荷叶预处理 3
2.2.2 标准曲线的绘制 3
2.2.3 荷叶黄酮的提取 4
2.2.4 荷叶黄酮含量的测定 4
2.3 抗氧化实验 4
2.3.1 荷叶黄酮对羟基自由基的清除能力的测定 4
2.3.2 荷叶黄酮对超氧阴离子清除能力的测定 5
3 结果与分析 6
3.1 单因素对荷叶黄酮提取率的影响 6
3.1.1 微波功率对荷叶黄酮得率的影响 6
3.1.2 料液比对荷叶黄酮的得率的影响 6
3.1.3 提取时间对荷叶黄酮的得率的影响 7
3.2 响应面试验方案及结果 8
3.2.1 超声-微波辅助提取荷叶黄酮最佳条件的确定 8
3.2.2 试验方案及结果分析 8
3.2.3 黄酮得率的方差分析 9
3.2.4 响应曲面和等高线图分析 10
3.2.5 响应面优化与验证实验 11
3.3 抗氧化分析 12
3.3.1 羟基自由基清除能力的测定 12
3.3.2 超氧阴离子清除能力的测定 13
4 结论 13
参考文献 14
致谢 15
1 前言
1.1 荷叶概述
荷叶是睡莲科植物莲的叶，生长在水、池塘或湖泊中，在我国南北各地均有栽培，资源十分丰富[1]。据《本草纲目》记载，“荷时服之，令人瘦劣。”荷叶中除含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、单宁等常规化学成分外，还有具有明显生物活性和生理功能的荷叶碱和黄酮类化合物这两大类物质。
荷夏秋开花，花色艳丽，出淤泥而不染，极具观赏价值。中国卫生部将荷叶列入第二批“既是食品又是药品”的名单中。目前荷叶资源尚未被充分利用，从中提取荷叶有效成分是利用资源的有效途径之一[2]。
荷叶黄酮是荷叶中提取的一种黄酮类物质，它是荷叶中的有效成分之一。现代医学研究证明，荷叶黄酮主要有抗病毒、抗癌、抑菌、抗过敏、抗血管脆性和血小板聚集、降胆固醇、降血脂、治疗心脑血管疾病、抗过氧化作用和抗糖尿病并发症等多种生理活性与药理作用[3~7]。
1.2 黄酮类化合物的主要提取方法
1.2.1 水提法
荷叶中的黄酮类化合物大多数是以黄酮苷的形式存在[8]，而黄酮苷一般易溶于热水。用水作溶剂提取得到的黄酮得率一般不高，提取物中含有较多的杂质，而且由于水的极性较大易将糖类、蛋白质等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液在存放时容易腐败变质。水提法的优点是试剂无毒，提取成本较低，设备简单。
1.2.2 醇提法
醇提法是黄酮类化合物最常用的方法，一般使用甲醇或乙醇提取。乙醇的溶解性比较好，对细胞的穿透能力较强。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格低廉，来源方便，而甲醇具有毒性，所以醇提法一般使用乙醇提取。与水提法相比，醇提法提取不仅缩短了提取时间，提高了黄酮的提取率，降低了能耗。
1.2.3 超声波法
超声波法是在原溶剂提取的基础上用超声波辅助处理的一种荷叶黄酮的提取方法。它是利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等破坏植物细胞，使溶剂易于渗入细胞，加速黄酮的浸出提取，从而加快提取速度和提高提取率[9]。超声场对黄酮类化合物提取的辅助作用除了来源于超声空化外，超声的机械效应和热效应也有一定的贡献。超声空化时会产生极大的压力，这个压力不仅使植物的细胞壁在瞬间被破碎，而且会引起微扰效应、湍动效应、聚能效应及界面效应。这些效应中，机械效应和湍动效会通过减薄传质边界层来增大传质速率；黄酮类物质的微孔扩散通过微扰效应被强化；界面效应增大了传质表面积；黄酮类物质的分子扰动由于热效应和聚能效应而被加快；在整体上，提取过程的传质速率和效果通过以上方面得到了提高，从而起到了辅助提取的效果。超声波法具有提取的温度低、提取的时间短、提取物的结构未被破坏和提取率高的特点
1.2.4 微波法
微波法是今年来发展较快的一种方法。它是通过微波场的热效应、生物效应及“扰动”效应等效应加快物质的扩散溶解，从而有效地提高黄酮类化合物提取的得率和含量。微波场主要通过对细胞膜的生物效应从而辅助提取黄酮类化合物：升高细胞内部的温度，增大压力，当细胞壁的承受能力小于其压力时，细胞壁会发生破裂，释放出细胞中的黄酮类化合物，周围的溶剂会将其溶解，所以其质量传递和热量传递的方向是一致的，这有助于黄酮类化合物的快速溶出。此外，微波对黄酮类化合物不仅可以通过热效应使温度迅速升高，增大扩散系数，而且会在固体表面的液膜上产生一定的微观“扰动”，降低了传质阻力，有效提高了黄酮类化合物的得率和含量，取得辅助提取的效果。微波法具有选择性高、提取时间短、溶剂用量少、耗能低、对环境安全无害等优点[10]。
1.2.5 其他方法
随着现代提取技术的发展，出现了一些高效、安全、操作方便的现代提取方法，如超临界流体萃取法、酶法提取、半仿生提取法、膜分离法等。这些新方法具有各自的优势，例如提取效率高、提取时间短、提取温度低、溶剂用量少和可循环使用等优点，不仅提取方法先进快捷，而且所得黄酮产品质量也优于用以往提取方法获得的黄酮产品质量。
此外，经过有关专家的反复试验，成功地开发出将超临界二氧化碳萃取技术与传统提取、浓缩和萃取技术相结合，制备高纯度黄酮的新工艺。该工艺既提高了黄酮的纯度和得率，又符合工业化生产对原料、溶剂使用、制作路线、生产过程安全性和产品颜色、产率、纯度诸方面的要求，有利于黄酮更有效地在医药和食品工业中应用。
1.3 研究意义
综合大量文献报道的荷叶黄酮的提取方法，发现大多采用单一的提取方法，如水浴浸提、醇提法、超声、微波，传统的提取方法存在提取率低、提取时间长的缺点。
近年来，超声辅助萃取技术和微波辅助萃取技术被广泛应用于各种植物的有效成分的提取研究上，并取得了一定的研究成果。但是关于超声和微波相结合的辅助技术提取荷叶黄酮还未见报道。为此本实验将超声辅助萃取技术和微波辅助提取技术结合起来，充分综合利用超声波和微波的优点，以此来对超声-微波协同辅助提取荷叶黄酮的最佳工艺条件进行探讨。随着人们对物质生活水平和对生活质量的要求的不断提高，人们对保健知识的需求也与日俱增，而人体内自由基的存在则极大的影响了人类的身体健康，因此，高效无毒的天然抗氧化剂
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