本实验以杏鲍菇为原料，经过酶解制备抗氧化肽。以DPPH自由基清除率为评价指标，采用单因素实验和正交实验优化酶解工艺，探讨不同条件下的酶种类，酶解温度、酶解时间、底物浓度和酶浓度对抗氧化肽活性的影响。用Box-Behnken试验设计的响应面（RSM）分析方法优化实验结果，确定酶解杏鲍菇蛋白制备抗氧化肽的最佳工艺条件为酶浓度1.01%、底物浓度2.08%、酶解温度54.13℃、酶解时间0.5h，其DPPH自由基清除率为85.36%。关键词 杏鲍菇蛋白，抗氧化肽，酶解
目 录
1 引言 1
1.1杏鲍菇 1
1.2研究意义 1
1.3抗氧化肽的种类 2
1.4抗氧化肽的作用机理 3
1.5抗氧化活性的检测方法 3
1.6抗氧化肽的制备方法 3
1.7抗氧化肽的分离纯化 4
1.8抗氧化肽的研究现状 5
1.9前景展望 5
2实验材料与方法 6
2.1 实验材料 6
2.2实验方法 7
2.3单因素实验 7
2.4正交实验 7
2.5响应面优化实验 8
2.6 Vc的阳性对照试验 8
3结果分析 8
3.1单因素实验结果分析 8
3.2正交实验结果分析 12
3.3响应面实验与结果分析 14
3.4 Vc的阳性对照实验与结果分析 19
4 结论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
自从自由基理论被提出，人体内氧化反应所产生的自由基与人体产生的许多疾病有着密不可分的关系。因此，对抗氧化肽的研究成为了人们克服抗衰老和防疾病等问题的重要方向。抗氧化肽具有清除自由基，阻断氧化反应，进而提高人体抵抗疾病的能力。天然抗氧化肽因具有安全高效、无毒副作用的优点，更是备受人们青睐[1]。目前，国内对天然抗氧化肽制备的研究主要停留在碱提酸沉的化学制备法上[2,3]，酶解制备研究较少，其制备原料也以多糖为主体 [25]。这些研究在为推进制备抗氧化肽进程提供依据的同时，不仅暴露了当 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
下人们对高效、安全提取抗氧化肽的急切要求，还反映了目前市场上的供给不足。因此，高效、安全、迅速地提取抗氧化肽具有广阔的市场前景和研究意义。
1.1杏鲍菇
为了高效地获得优质的抗氧化肽，选择合适的材料是十分必要的。杏鲍菇是近年来兴起的一种大型优质的珍稀食用菌。它的菌柄和菌盖质地脆嫩，肉质肥厚，味道鲜美，具有独特的杏仁香味和鲍鱼味，也被称做杏仁鲍鱼菇[48]。其子实体色泽雪白，质地脆嫩，有着“雪茸”，有“平菇王”、“干贝菇”、“草原上的美味牛肝菌”等多种美誉[31]。杏鲍菇的蛋白质含量丰富，八种氨基酸齐全[58]。Mariga等[9]对杏鲍菇蛋白进行了关于多种肿瘤细胞增殖抑制作用及免疫细胞生长影响作用的大量体外实验。其研究结果表明杏鲍菇蛋白具有良好的抗氧化、抗肿瘤作用和免疫调节活性，因此杏鲍菇作为一种广泛种植的大型菌，其蛋白具有良好的产品开发潜质和广阔的市场前景[912]。
1.2研究意义
随着生活水平的提高，人们已逐渐将食品消费的诉求从感官要求转向了保健和延年益寿等方面上。抗氧化肽因为具有消除自由基、抑制或减缓氧化反应等优势，被应用于改善食品品质、延长食品的保质期；又因为其在生物体内可以起到减轻自由基对机体的损伤等作用，其应用前景非常广阔。
在前人的研究基础上，本文将采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别进行水解杏鲍菇蛋白制备抗氧化肽的实验。探讨不同条件下的酶种类，酶解温度、酶解时间、底物浓度、酶浓度制备出的抗氧化肽活性。以DPPH自由基清除率为评价指标，根据单因素实验和正交实验的结果，用BoxBehnken试验设计[1113]的响应面(RSM)分析方法优化实验结果，从而确定酶解杏鲍菇蛋白制备抗氧化肽的最佳工艺条件，为酶解杏鲍菇蛋白制备抗氧化肽的工业化生产提供理论依据，也为日后的进一步深入研究提供方向和理论基础。
1.3抗氧化肽的种类
人们已经研究过的抗氧化肽的种类有很多。从性质上，大致上可分为天然抗氧化肽和人工合成肽两大类。从来源上则可分为植物性抗氧化肽和动物性抗氧化肽。常见的有大豆肽、乳蛋白肽和肌肽。这些抗氧化肽有的通过直接提取就可以获得，有的则需要通过水解蛋白质的方法才能获得[14,15]。
大豆肽即大豆蛋白水解后所得到的肽。Wendee Chiang等人[16]在酶膜反应器中对大豆多肽进行了连续生产。因为其反应过程及时地分离了酶解所生成的多肽物质，消除了产物本身的反馈干扰，从而提高酶解效率。所以在检测其大豆分离蛋白及水解物的抗氧化活性后，其结果表明：大豆分离蛋白被酶解后，抗氧化活性明显提高。Hua ingchen等人[17]在水解大豆蛋白时，分别选用了5种不同的蛋白酶进行水解实验，将硫酸氰铁法检测的不同水解产物的抗氧化活性作为评价的指标，再采用G25凝胶层析和反相高压液相色谱进行水解产物的分离、纯化实验，然后检测出不同大豆多肽的抗氧化活性，最后得到了6个抗氧化肽的氨基酸序列。
作为乳品深加工的理想产品，乳蛋白肽一直被广泛的应用于食品行业。刘志东等用大量实验研究了乳清分离蛋白（WPI）酶解物清除自由基的效果，结果证明木瓜蛋白酶的酶解物和胰蛋白酶的酶解物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力和还原能力比胰凝乳蛋白酶的酶解物和胃蛋白酶的酶解物的清除能力和还原能力更强[18]。关于酪蛋白及酪蛋白水解肽的抗氧化活性，一般认为酪蛋白本身具有抗氧化活性，不会因为脱磷酸作用和水解作用而失去这一活性，Sandrine Rival等人的研究可以进一步证实这一观点[19]。该实验结果有利于推动运用酪蛋白及酪蛋白水解肽作为抗氧化剂研究的进程进一步加快。
1900年，人们在俄国首先发现了肌肽。这是一种天然的水溶性二肽。Eun—Kyung Kim等人通过纯化鹿肉酶解物来获得这种抗氧化肽[20]。
还有一些其他肽类也被人们逐渐纳入视线范围。比如谢正军等人[21]进行了关于苜蓿叶蛋白抗氧化肽水解用酶的筛选实验，结果表明制备苜蓿叶蛋白抗氧化肽的最适水解酶是碱性蛋白酶。Anne Pihlanto等人[22]对水解马铃薯蛋白所得到的产物进行了分离、纯化，并检测了抗氧化活性，从而肯定了马铃薯的生物价值。

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