聚酮类化合物指的是由聚酮类化合物生物合成路径合成的所有化合物的总称。包含大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等的化合物。由于生物合成过程中元件的改变及其组合方式变化多端，可生成的化合物的数目极其庞大。结构的多样性导致了生物活性的多样性。Ⅱ型聚酮化合物作为聚酮类化合物中的一类，其生物活性同样具有多样性。研究聚酮生物合成途径而发展起来的组合生物合成近几年取得了很大的发展，是获取生物多样性的重要手段，成为新药开发的重要策略之一[1-4]。本课题通过研究Ⅱ型聚酮化合物的分离和提取，为日后Ⅱ型聚酮化合物的工业化生产提供便利条件。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
材料 2
1.1.1　二型聚酮化合物阳性单克隆产物2
1.1.2　主要试剂和仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 二型聚酮化合物阳性单克隆产物制备2
1.2.2　二型聚酮化合物阳性单克隆产物的发酵3
1.2.3　二型聚酮化合物的分离3
1.2.4　二型聚酮化合物的纯化3
2 结果与分析3
2.1　克隆产物HPLC分析3
3　讨论 4
致谢5
参考文献5
二型聚酮单克隆发酵产物分离提取研究
引言
引言：微生物的次级代谢产物生物合成过程中需要由多酶体系介入其中，这些多酶体系中的各个酶系均按照一定组织结构协调起作用。聚酮类化合物的产生途径主要来源于细菌、真菌、放线菌或植物等。聚酮类化合物是一种天然产物，结构多种多样，但其生物合成过程中有着相同的机制，即均由多酶体系――PKS进行催化[56]。
Ⅱ型聚酮化合物是一个多功能酶复合体，它只包括一套可以反复进行利用的结构域，每一结构域在重复的反应步骤中多次的进行催化相同的反应过程。对于Ⅱ型聚酮化合物的研究近年来也在相关领域内取得了一些进展，例如杨克迁研究组对目前已知的氧化开环酶进行了系统发生分析，结果发现这类氧化酶形成了一个蛋白质家族，参与到不同骨架结构产物的生物合成过程中，并且不同的进化分 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
支与不同产物结构相关联。杨克迁研究组与中科院生物物理研究所刘志杰研究组合作，解析了氧化开环酶AlpJ的晶体结构。结果显示AlpJ结构可以分为N端结构域及C端结构域两部分，这两部分序列有较弱的相似性，并且与蒽酮加氧酶ActVAOrf6均表现出较弱的序列相似性。AlpJ晶体结构与ActVAOrf6二聚体结构可以很好地叠合，同时体积排阻色谱与静态光散射实验也表明AlpJ在溶液中以单体形式存在，表明AlpJ的单体是其生理活性状态。通过结构比较与分子对接确定了可能参与底物结合与催化的关键残基，并通过定点突变实验进行验证。AlpJ晶体结构与ActVAOrf6二聚体结构叠合显示AlpJ存在两个底物结合口袋，分别位于N端与C端结构域。定点突变实验表明，两个底物结合口袋都参与AlpJ的催化过程，并且两个结构域的界面也对其催化活性有重要影响。这些结果表明AlpJ的两个底物结合口袋可能存在协同作用。这一研究有助于加深对于氧化开环酶的催化功能及结构功能关系的认识。
Ⅱ型聚酮化合物的碳骨架是由最小迭代用酶催化的minimal PKS由2个酮酰合酶单元组成的异源二聚体和1个ACP构成。Ⅱ型聚酮合酶亚单位中还包括KR，环化酶和芳香化酶。这些酶类决定了初始聚酮化合物的折叠模式[78]。
乙酰辅酶A通常作为Ⅱ型聚酮化合物的起始单位，而丙二酰辅酶A则作为延伸单位。
KSα和KSβ亚单位中，两者显示出高度序列相似性。然而，与KSα相比，KSβ结构中缺乏一个半胱氨酸活性位点，该位点在聚酮化合物装配过程中起关键作用；但KSβ在碳链长度方面起着重要的作用，因此被称为链长因子。
1 材料与方法
材料
1.1.1二型聚酮化合物阳性单克隆产物
　　选择二型聚酮化合物生物合成基因的高度保守区域酮基合成酶结构域的简并引物以及合适的DNA模板进行PCR扩增，然后将PCR产物进行进行纯化。将已纯化的PCR产物导入到感受态细胞内，然后涂布于含氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃培养过夜。最终筛选出阳性克隆产物。
1.1.2主要试剂和仪器
RS培养基（1L:蔗糖103g；K2SO4 0.25g；MgCl26H2O 10.12g；葡萄糖10g；酪蛋白氨基酸 0.1g；微量元素溶液 2ml；酵母粉 5g；TES buffer 5.73g；加dd水至1L，灭菌后加入：KH2PO4 0.05g；CaCl2 2.22g；LProline 3g；NaOH 0.28g）；
ISP4培养基（L：可溶性淀粉 10g；磷酸氢二钾 1g；无水硫酸镁 1g；氯化钠 1g；硫酸铵 2g；碳酸钙 2g；树脂 20g，灭菌前加入：FeO47H2O 0.001g；MnCl2 0.001g；(NH4)2SO4 2g，灭菌后加入Apr）；甲醇；二氯甲烷；葡聚糖凝胶。
　　主要仪器： SL2001N型电子天平（上海民桥）, 4℃冰箱（中科美菱），超净工作台（AIRTECH),，UV2600型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯），恒温金属浴(major science,MS), 114型离心机（Sartorius AG），CT15R台式高速冷冻离心机（上海天美），超纯水仪（HITECH),HYGC型多功能摇床（培英），立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安）。
1.2 方法
1.2.1 二型聚酮化合物阳性单克隆产物制备
选择二型聚酮化合物生物合成基因的高度保守区域酮基合成酶结构域的ketosynthase domain[911]的简并引物以及合适的DNA模板，进行PCR扩增。
PCR反应条件为：预变性95℃4min,97℃1min；变性95℃40sec，退火68℃ 40sec，延伸72℃ 40sec，10个循环，退火温度每个循环降1℃；变性95℃ 40sec，退火58℃ 40sec，延伸72℃ 40sec，30个循环；最后延伸72℃ 10min。

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