Ⅰ型鸭肝炎病毒A66活疫苗耐热冻干保护剂配配方初步筛选
摘要：选取我国水禽养殖业中较为常见的鸭病毒性肝炎病毒（Duck viral hepatitis, DVH）为研究对象，以S3-T1为耐热保护剂基础方，通过EDTA﹑L-谷氨酸钠﹑BSA和NZA等单因素成分筛选，将鸭肝炎病毒进行冻干。通过样品形态观察、剩余水分、病毒含量测定等指标，筛选出配方S3-E2对鸭肝炎耐热保护效果较好，冻干过程病毒基本无损失，37℃ 10d加速耐老化试验中病毒含量下降0.5个滴度，稳定性好。研究结果为鸭肝炎耐热冻干保护剂的研制提供了科学依据，为疫苗的运输和保存提供了技术支撑。
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关键字:鸭肝炎病毒；耐热冻干保护剂；疫苗；单因素
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 病毒的增殖与收获 4
1.2耐热保护剂配方的设计4
1.3耐热保护剂的配制 4
1.4 真空冷冻干燥工艺流程5
1.5 配方真空冷冻干燥5
1.6冻干样品的筛选5
1.6.1 冻干样品的形态初步观察6
1.6.2 冻干样品残余水分测定6
1.6.3 冻干样品病毒含量测定6
2 结果6
2.1 冻干样品形态的初步观察筛选6
2.2 冻干样品残余水分的比较6
2.3 冻干样品病毒含量的比较6
2.4 筛选配方的复核6
3 分析讨论6
3.1 冻干过程不同阶段各温度控制对结果的影响6
3.2 保护剂配方中各单因素的作用6
3.3 EDTA﹑L-谷氨酸钠﹑BSA﹑NZA对最终结果的影响7
致谢7
参考文献7
图1：真空冷冻干燥工艺流程4
图2：合格冻干样品5
图3：不合格冻干样品5
表1：EDTA﹑L-谷氨酸钠﹑BSA﹑NZA各物质在不同配方中所占质量分数和总干物质量4
表2：各配方ELD50的测定6
表3：各配方剩余水分测定6
表4：S3-E2配方冻干后病毒含量6
Ⅰ型鸭肝炎病毒A66活疫苗耐热冻干保护剂配方初步筛选
引言
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatiti *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
s DVH）是鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus DHV）感染雏鸭引起的一种高度致死性的传染性病毒病[1-2]。主要发生于三周龄以下雏鸭，病死率达90%以上。其中Ⅰ型DHV呈世界性分布，严重阻碍养鸭业的发展[3-6]。而鸭肝炎病毒的活疫苗是预防此类传染病的主要疫苗之一。
目前国外进口活疫苗多采用耐热冻干保护剂。国外活疫苗冻干制品在2～8℃条件下保存期为12～36个月，但由于进口疫苗价格昂贵，且对我国流行病毒的针对性差等缺点，不适于我国养殖业[7]。我国大部分兽用冻干活疫苗，保护剂组方简单、配制简便，抗原对温度敏感，如果在2℃-8℃条件下，保存期只有4～6个月，而多数疫苗需要在-15℃以下保存[8]。这给疫苗的储存和运输带来很大的困难。
常温耐热型弱毒活疫苗，不仅克服了死疫苗免疫原性差、不能在体内繁殖、免疫剂量大、需多次免疫的缺点，而且克服了液体活疫苗滴降幅度大、稳定性差、需低温保存的缺点。已经研制出的耐热保护剂，通过区域试验，效果理想，获得广大养殖户的好评，解决了以前常常由于疫苗失效所引起的免疫失败问题，成功的预防和控制了畜禽疫病的发生和流行，具有极大的经济和社会效益[9]。
本试验通过单因素调配基础方中不同物质（EDTA、L-谷氨酸钠、BSA、NZA）的质量分数，从而初步筛选出Ⅰ型鸭肝炎病毒A66活疫苗耐热冻干保护剂优化配方。使其在较高温度下能较长时间保存，并能保证疫苗效价，为动物耐热活疫苗的制备提供技术支持，以解决疫苗长久以来依赖冷链运输、储存不便以及高成本等问题。
1. 材料与方法
1.1 病毒的增殖与收获
本实验选择9日龄的SPF鸡胚30枚。在接种之前进行照蛋检查，剔除死胚及弱胚。并在鸡胚上画出气室和接种位置，先用碘酊涂擦气室和接种部位然后再用75%的酒精进行消毒并打孔，在无菌环境中用0.85%无菌生理盐水将稀释100 倍后的DHV病毒液接种于鸡胚尿囊腔，0.2 mL/胚，用石蜡封孔。接种DHV后的鸡胚置于孵化温箱中培养，控制相对湿度为60%，温度为37.5℃左右，每日翻蛋2次，每天照蛋，弃去24h内死亡的鸡胚，收集24～72h内死亡鸡胚，将超过96h不死亡鸡胚弃去。在无菌环境中收取尿囊液和胚体，并捣碎离心，弃掉组织取上清，并将其保存于-20℃中备用。
1.2 耐热保护剂配方的设计
本试验是对耐热保护剂基础方A（S3-T1）的优化，即在基础方A的基础上进行EDTA﹑L-谷氨酸钠﹑BSA﹑NZA比较，进行耐热保护剂的单因素筛选。在保护剂配方中如果冻干制剂浓度低，干物质含量少，冻干时已经干燥的部份会被升华气流带走。所以一般在进行冻干时固体物质的浓度在4％～25％之间。
EDTA(%)L-谷氨酸钠(%)BSA(%)NZA(%)干物质(%)
1S3-E10.53.03.00 复合组方A 18.52
2S3-E22.03.03.0020.02
3S3-L11.00.753.0016.77
4S3-L21.01.53.0017.52
5S3-B11.03.01.5017.52
6S3-B21.03.00.7501 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
6.77
7S3-N11.03.002.018.02
8S3-N21.03.01.02.019.02
9S3-T11.03.03.0019.02
表1：EDTA﹑L-谷氨酸钠﹑BSA﹑NZA各物质在不同配方中所占质量分数和总干物质量
1.3耐热保护剂的配制
保护剂配制分为二部分：保护剂成分A（能高温灭菌的部分）和保护剂成分B（不能高温灭菌的部分）。将A和B部分各加0.2mol/L的Tris溶液50ml溶解。由于A部分比较难溶，所以在沸水中进行煮沸使其溶解，溶解后采用110℃20min灭菌方法进行高压灭菌。将B部分用电磁搅拌器搅拌3-4h，待完全溶解后采用0.22微米过滤器在无菌环境中进行过滤。使用时二者按比例混合后，配制疫苗。配方与同一批鸭肝炎活疫苗病毒液按体积比1:1配制疫苗后进行冷冻干燥。使用前应将所配置保护剂在37℃预温2h，并充分混合摇匀。
1.4 真空冷冻干燥工艺流程
图1：真空冷冻干燥工艺流程
真空冷冻干燥分3个步骤。首先是预冻过程, 预冻的速度与温度根据物质的种类而定, 一般预冻温度常为-40℃。在整个预冻过程中物质内部的游离态水由游离态转变为固态，使产品形态固定。其次是升华过程（一级干燥）,预冻好的物质在高真空度的环境中,冰晶吸热而直接变成水蒸气。再次是解析干燥（二级干燥）过程, 这一过程使得残留在微生物体内的结合态水解析出来, 进一步降低物质体内水分的含量。随后待解析干燥结束后，在真空环境中进行压盖[12]。
1.5 疫苗真空冷冻干燥
在本实验配方中EDTA（乙二胺四乙酸）是作为保护剂PH调节剂，将保护剂PH调节到活性物质的最稳定区域。
[4] Kim M C, Kwon Y K, Joh S J, et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J]. Archives of virology, 2007, 152(11): 2059-2072.
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