抗鸭病毒性肝炎中药成分复方的初步筛选[20200507191540]
摘要：为研制抗鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）中药成分复方新药，本实验从淫羊藿黄酮（Epimedium flavone, EF）、三七黄酮(Notoginseng flavone, NF)、野菊花黄酮(Wild chrysanthemum flavone, WCF)、黄芩苷(Baicalin, BA)、栀子苷(Geniposide, GP)、地黄苷(Rehmannioside, RN)、地黄多糖(Radix Rehmaniae Preparate Polysaccharide, RRPP)、夏枯草黄酮(Selfheal flavonoids, SF)8种中药成分中筛选出有较好抗鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）的单味中药成分后根据中药配伍原则进行组方，并对中药成分复方进行体内外抗鸭肝炎病毒试验，以期筛选出体内外均有较好的抗DHV效果的复方。结果显示：由EF、NF、WCF、BA组成的复方EF-NF-WCF-BA，由EF、RRPP、WCF、BA组成的复方EF-RRPP-WCF-BA，由EF、RN、WCF、BA组成中药成分复方EF-RN-WCF-BA，由EF、RRPP、RN、WCF、BA组成中药成分复方EF-RRPP-RN-WCF-BA在体外均有较好的抗病毒效果；复方EF-RRPP-WCF-BA、EF-RN-WCF-BA在体内有较好的抗病毒效果。综合经济、药物资源等因素，最终确定EF-RRPP-WCF-BA为抗DVH最佳中药成分复方。
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关键字:鸭病毒性肝炎；中药成分复方；抗病毒
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 主要试剂 3
1.1.2 鸭肝炎病毒、鸭胚及雏鸭 3
1.1.3 主要仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 中药成分准备 3
1.2.2 鸭胚肝细胞单层（duck embryonic hepatocytes, DEHs）的准备 4
1.2.3 八种中药成分体外鸭胚肝细胞(DEHs)最大安全浓度的测定 4
1.2.4 八种中药成分体外抗DHV-1感染鸭胚肝细胞 4
1.2.5 中药成分复方体外鸭胚肝细胞(DEHs)最大安全浓度的测定 4
1.2.6 中药成分复方体外抗DHV-1感染鸭胚肝细胞 4
1.2.7 体内中药成分复方抗DHV-1感染雏鸭试验 4
1.2.8 数据统计 5
2 结果与分析 5
2.1 八种中药成分体外抗DHV-1效果筛选 5
2.1.1 八种中药成分体外鸭胚肝细胞(DEHs)最大安全浓度 5
2.1.2 八种中药成分体外抗DHV-1感染鸭胚肝细胞效果 6
2.2 中药成分复方体内体外抗DHV-1筛选 7
2.2.1 中药成分复方体外DEHs安全浓度 8
2.2.2 中药成分复方体外抗DHV-1感染鸭胚肝细胞效果 8
2.2.3 体内中药成分复方抗DHV-1感染雏鸭试验结果 9
3 讨论 10
3.1  *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
结果的讨论 10
3.2.1 中药成分安全浓度及抗DHV-1浓度比较 10
3.2.2 中药成分复方抗病毒作用 11
3.2.3 中药成分复方与单味成分抗病毒比较 12
3.2.4 中药成分复方体内体外抗DHV-1效果比较 12
3.2.5 中药成分抗DHV-1与其他作用比较 12
3.2 本实验优化的方法 13
3.2.1 MTT法应用于测定鸭胚肝细胞活性 13
3.2.2 鸭胚肝细胞培养技术的优化 13
3.2.3 中药成分复方成分明确性 13
3.3 本实验的研究意义 13
4. 结论 14
致谢 14
参考文献 14
抗鸭病毒性肝炎中药成分复方的初步筛选
引言
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）感染引起的一种传播迅速、高发病率急性、接触性和高度致死性传染病，也是一种理想的人类肝炎研究疾病模型。其临床特征为患鸭在临死时常常发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”的特异姿势，俗称“背脖病”。DVH自然爆发时仅发生于雏鸭，且主要为21日龄以内的雏鸭，以4-8日龄雏鸭最易感染，成年鸭呈隐性感染，无临诊症状，但能排毒。雏鸭的发病率为20%-100%[1-2]。随着养鸭业不断向产业化、集约化和规模化方向发展，DVH的危害日趋严重，临床上一旦发病，因缺乏有效的药物治疗而造成大批死亡，对今后DVH的综合防控提出了新的挑战。
鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus, DHV），微RNA病毒科，目前有 3 个血清型，3 个型有着明显的差异，无交叉免疫性。目前我国发生和流行的主要是1 型鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus 1, DVH-1），1 型毒株内还存在变异株1a 型。鸭病毒性肝炎的病原包括1型鸭肝炎病毒及其变异株（1a 型）、3型鸭肝炎病毒和鸭星状病毒（Duck astrovirus）。其中1型鸭病毒性肝炎呈世界性分布，而3型鸭病毒性肝炎则具有很明显的地域性。至今，3型鸭病毒性肝炎主要在美国发生。DHV-1型在由Levine 等在1949年首次在纽约长岛分离[3]，为经典株，呈世界型分布。DHV-1在2008年更名为DHAV（Duck Hepatitis A Virus, DHAV）。因此，DHV-1是世界范围内造成鸭病毒性肝炎流行的主要病原。
由于病毒毒力的增强和疫苗、免疫等诸多问题，以及没有特效的临床治疗用药物，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一。而随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。目前，世界范围内临床上还没有有效的抗由DHV-1引起的DVH的药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。虽然卵黄抗体、高免血清和单克隆抗体治疗鸭肝炎有很好的疗效，但价格较贵，保存运输不便。而抗病毒中药疗效稳定，毒副作用较小，药源丰富，价格低廉，具有广泛的发展前景。抗病毒化药只可抑制病毒增殖与扩散，并不能阻止病毒感染，对病毒不起决定性的治疗作用，而且化 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
药常在杀灭病毒时对正常细胞也会造成损伤。中药是多组分的复合体，一味中药有时会含有多种抗病毒成分，具有较广泛的抗病毒作用。
1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道[4-6]。本实验室也发现了多种中药多糖及其硫酸酯能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染[7-11]。现代医学研究表明，山豆根多糖具有良好的抗氧化作用[12-13]，经过硫酸化修饰的硫酸化山豆根多糖在体外对肝炎病毒表现出良好的抑制作用[14]。黄芩苷（Baicailin, BA）在体内外均有有效的抗病毒作用[15-19]，还具有抗炎[20-21]，镇痛[22]和抗氧化[23]作用。
中药通过直接和间接两种途经发挥抗病毒作用，直接抗病毒是侵入前阻止吸附，细胞内抑制增殖和抗表达再感染；间接抗病毒是对机体免疫系统的调节影响。抗病毒中药可以刺激机体的免疫系统产生白细胞介素、干扰素[24]等细胞因子，降低毒素对机体的损害，通过免疫细胞识别和吞噬病毒而双向调节机体免疫系统。DHV-1和NDV具有某些相似性，感染机体后引起的机体损伤也都是一种广泛性损伤，肝、肾、脾都存在严重损伤，且这种损伤并非完全由病毒直接所致。王丙云等[25]发现感染肝炎病毒后雏鸭肝组织的抗氧化功能明显下降，清除自由基能力减弱，提示自由基含量的增加是鸭病毒性肝炎的发病机制之一，提示治疗鸭病毒性肝炎的药物筛选可从抗氧化方面入手。据报道[26]，夏枯草黄酮(Selfheal flavonoids, SF)对DPPH自由基、羟基自由基有很强的抑制作用,提示其有较好的抗氧化作用。中兽医实验室的研究发现黄芪多糖、淫羊藿多糖、人参皂苷、蜂胶黄酮等中药成分及其组成的复方能显著提高雏鸡T淋巴细胞转化，提高ND和IBD疫苗免疫水平，同时，促进淋巴细胞INF-γ和IL-2的表达水平，从而抵抗NDV强毒的攻击[27-29]。这为探究中药苷类成分及修饰物增强雏鸭抗DHV-1的研究提供了坚实的理论基础和实践经验。张玉清等[30-31]证明淫羊藿总黄酮（Epimedium flavone, EF）、黄芩总黄酮、野菊花总黄酮(Wild chrysanthemum flavone, WCF)、三七总黄酮(Notoginseng flavone, NF)有较好的抗NDV病毒作用。有实验[32-33]发现夏枯草总三萜、栀子苷(Geniposide, GP)具有良好保肝作用。同时，多糖抗DHV-1也具有一定的作用。陈云[34]研究表明山豆根多糖体内体外抗DHV-1都有良好效果。

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