狂犬病病毒胶体金检测试纸的研制[20200507185849]
摘要：[目的] 应用双单抗夹心法，建立狂犬病病毒快速检测技术，制备快速检测试纸并初步应用。[方法] 以20nm胶体金标记抗狂犬病病毒核蛋白单抗制备金标抗体，以Millipore-135硝酸纤维素膜为层析介质，分别以抗狂犬病病毒磷蛋白单抗和羊抗鼠IgG包被检测线（T线）和对照线（C线）制备狂犬病病毒双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸。以试纸对狂犬病感染阳性、阴性脑组织进行检测，评价该试纸的检测敏感度和特异性。[结果] 狂犬病病毒核蛋白与胶体金标记的最佳浓度为12µg/mL，此时获得的胶体金在Millipore-135膜上扩散良好；以浓度2.0mg/mL的抗狂犬病病毒磷蛋白单抗包被T线，以浓度1.0mg/mL羊抗鼠IgG包被C线制备的检测试纸对狂犬病病毒带毒脑组织（104.5LD50/30µL）和细胞培养液（106.5TCID50/100µL）进行检测时，分别稀释1:150和1:128倍时，仍可以检出，敏感性良好；对非带毒脑组织及其它病毒的培养液均不能检出，特异性良好。检测过程不超过10min。[结论] 成功建立用于狂犬病病毒检测的胶体金免疫层析技术，制备的检测试纸可成功检出狂犬病病毒带毒脑组织和细胞培养物，敏感性满足临床应用，特异性良好。该技术具有操作方便、快速和结果直观、容易判定的优点，可以实现狂犬病的现场和早期检测，为狂犬病暴露后处置提供了有力工具。
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关键字:胶体金；狂犬病病毒；检测
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 抗体纯化材料2
1.1.2 金标抗体材料2
1.1.3 制备检测试纸材料2
1.1.4 检测样品2
1.2 方法 2
1.2.1 抗体纯化2
1.2.2 抗体筛选4
1.2.3 金标抗体制备4
1.2.4 样品处理液筛选及样品处理5
1.2.5 试纸条制备5
1.2.6 试纸条检测性能测试7
2 结果与分析7
2.1 抗体纯化7
2.1.1 金标抗体的合适纯化方式7
2.1.2 T线所用抗体合适纯化方式8
2.1.3 C线所用抗体合适纯化方式8
2.2 检测试纸各部分所用抗体的选择9
2.2.1 最适金标抗体和检测线包被抗体的的选择9
2.2.2 质控线包被抗体的选择和包被浓度的确定9
2.3 金标抗体的制备9
2.3.1 最适蛋白标记量的确定9
2.3.2 金标抗体10
2.4 样品处理液的确定以及样品的合适处理方法10
2.5 检测试纸的检测性能试验结果11
2.5.1 特异性检测11
2.5.2 敏感性检测11
2.5.3 稳定性检测11
3 讨论 11
3.1 狂犬病病毒检测试纸的检测性能12
3.2 关于T线包被抗体的选择问题12 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q:  3_5_1_9_1_6_0_7_2 
/> 3.3 样品处理液的pH值对检测结果的影响12
3.4 稳定性不良的原因分析12
3.5 关于胶体金标记抗体抗体13
3.6 抗鼠IgG血清直接包被C线时，C线与吸水垫之间出现抹带的原因分析13
3.7 不同规格NC膜对检测敏感性和特异性的影响13
3.8 有待于进一步研究的问题13
致谢14
参考文献14
狂犬病病毒胶体金检测试纸的研制
引言
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 蛋白纯化
1.1.1.1 主要试剂：Tris（购自国药化学试剂有限公司）；Gly（购自AMRESCO）；乙醇（购自北京试剂）；碳酸钠和碳酸氢钠（均购自北京试剂）；含有鼠抗狂犬病病毒N蛋白McAb的小鼠腹水；含有鼠抗狂犬病病毒P蛋白McAb的小鼠腹水；羊抗鼠或兔抗鼠IgG血清（实验室制备，-80℃保存）。
1.1.1.2 主要器材：蛋白A亲和层析柱（GE Healthcare公司生产）；1.5 mL离心管；4 ℃冰箱；4 ℃离心机；透析袋；封口夹；透析容器（容积在2L左右）。
1.1.2 金标抗体
1.1.2.1 主要试剂：胶体金（上海杰一生物技术公司生产，粒径在20 nm左右[3, 4]）；经纯化透析处理且已知浓度McAb；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA， amresco公司生产）；氯化钠，碳酸钾，硼酸和硼酸钠（北京试剂生产）；蔗糖（北京化工厂生产）。
1.1.2.2 主要器材：4 ℃离心机（eppendorf公司生产）；离心管（1.5 mL、0.5 mL）；精密pH值检测试纸（Sigma公司生产，范围有0~4.5，4.5~10.0)。
1.1.3 检测试纸制备
1.1.3.1 主要材料：有被衬硝酸纤维素膜（M135、M180，millipore），玻璃纤维垫，吸水垫，塑料底板（均购自上海杰一生物技术公司）；37 ℃温箱（BOXUN公司生产）；记号笔。
1.1.3.2 主要工具：免疫层析划膜器具套装（购自上海杰一生物技术有限公司）。
1.1.4 检测样品
狂犬病病毒标准攻击毒株（Challenge Virus Standard，CVS-11（106.5 TCID50/100µL））；阳性鼠脑（CVS-24（104.5 LD50/30µL），HZ10，189，SXHZ），阴性鼠脑；FMDV（口蹄疫病毒）细胞毒；SPIV（牛副流感病毒）细胞毒；样品处理液（10 mmol/L硼酸盐缓冲液，3% BSA，0.2% T-20）；DMEM；PBS；生理盐水。
1.2 方法
1.2.1 抗体纯化[5]
1.2.1.1所需试剂的准备
（1）1 mol/L Tris-Cl：准确称取121.4gTris，于80mL左右蒸馏水中完全溶解，补充容积至100mL，配制成1mol/LTris溶液，用HCl调节pH值至8.0，备用。
（2）100 mmol/L Tris-Cl：用蒸馏水对1 mol/L Tris进行10倍稀释，以HCl调节pH值至8.0，备用。
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（3）10 mmol/L Tris-Cl：用蒸馏水对100 mmol/L Tris进行10倍稀释，以HCl调节pH值至8.0，备用。
（4）100 mmol/LGly：准确称取7.5gGly，于80mL左右蒸馏水中完全溶解，补充容积至100mL，以HCl调节pH值至3.0，备用。
（5）20%乙醇：取20mL无水乙醇，加入到80mL蒸馏水中，混匀，备用。
（6）8.5%NaCl：准确称取8.5gNaCl，于80mL左右蒸馏水中完全溶解，补充容积至100mL，备用。
（7）饱和硫酸铵溶液：室温下，在适量蒸馏水中加入硫酸铵至不再溶解为止。
（8）100 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2）：准确称取碳酸钠1.35g，碳酸氢钠7.36g，用适量蒸馏水完全溶解后定容至1000mL。
1.2.1.2 纯化方法
本试验所用抗体有小鼠腹水中的抗N、P、G蛋白McAb和羊抗鼠、兔抗鼠IgG血清中的二抗，腹水中含有大量细胞碎片、脂类等影响纯化的物质，血清中也含有凝血块等大颗粒的杂质，故纯化前须经过离心对样品处理。如果样品为腹水，10000 r/min，5 min离心，2 mL注射器穿过上层油膜吸取介于油膜和下层沉淀之间的澄清液体于另一离心管中，备用；如果待纯化抗体为血清，10000 r/min，5 min，离心后将上清转移至另一离心管中，备用。
根据待纯化抗体的用途可以选择以下两种方法对腹水和血清中的抗体进行纯化。
（1）蛋白A柱亲和层析法（以离心处理好的1 mL腹水为例）：①向离心处理好的1 mL腹水中加入110 µL 1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）（使Tris-Cl终浓度为100 mmol/L，将抗体粗品（血清或腹水）的pH值调整到8.0），混匀。②蛋白A柱用3倍柱床体积100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）洗涤2次。③封闭柱下方出口，将抗体溶液加入蛋白A柱，（必要时可用1 mL 0.1mol/L Tris-Cl（pH 8.0）冲洗EP管中残留的腹水或血清，或扩充样品体积，增加目的抗体与SPA的接触面积），并将待纯化抗体与蛋白A混匀，置于4 ℃环境下作用30 min，每10 min取出混匀一次。④用5倍柱床体积的100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）洗涤蛋白A柱2次。⑤用5倍柱床体积的10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）洗涤蛋白A柱2次。⑥待柱中10 mmol/L Tris-Cl全部流出后，封闭层析柱下方出口，用100 mmol/L Gly（pH 3.0）逐步洗脱：加入1 mL 100 mmol/L Gly（pH 3.0），混匀，静置1 min，用预先加入100 µL（1/10体积）1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）的EP管或青瓶接收洗脱液，混匀，之后重复上述步骤两次。⑦以1 mL 100 mmol/L Gly（pH 3.0）与100 µL 1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）混合作为对照，测定各阶段收集蛋白的浓度，根据情况舍弃浓度较低的蛋白收集液，将之前收集的各管蛋白合并，在100 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.2）中透析12~24 h。测定蛋白浓度，分装，标记，存放于-20 ℃中备用（4 ℃冰箱中只可做短期保存）。如需浓缩，将透析袋悬挂在电风扇前加快水分的蒸发至合适体积和浓度。⑧蛋白A柱再用2倍柱体积100 mmol/L Gly（pH 3.0）充分洗脱残留的结合蛋白，以免影响下次使用。⑨用10倍柱床体积的100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）洗涤蛋白A柱。⑩用4倍柱床体积的20%乙醇洗涤蛋白A柱，之后将柱子下方出口封闭，再向柱子中加入4倍柱床体积的20%乙醇，封闭上方入口，置于4 ℃保存。如果两次使用间隔较短（1天左右，可直接以100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）保存）。

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