猪圆环病毒的PCR诊断与防制[20200507184554]
摘要：猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是目前发现的最小的动物病毒。PCV有2个血清型其中1型猪圆环病毒（PCV1）为非致病性的病毒，而2型猪圆环病毒（PCV2）具有致病性，是断奶猪多系统衰弱综合征(postweaning multisystemwasting syndrome，PMWS)的病原体。本试验根据PCV2基因序列设计合成一对特异性引物：P1: (5’-AGCGCGGGCACGGGTACCCGGTACCGT-3’)和P2: (5’-GCG
GAATTCGGTTTTTATTCTGTCTGG-3’)，本实验通过建立一种特异性和敏感性均较好的PCR方法，能够检测PCV2，在一定程度上缩短病原体鉴定的时间，能够应用于PCV2的分子流行病学调查。
发病猪场应采取相应防控措施控制疾病蔓延。
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
关键字:猪圆环病毒；PCR；诊断；防制
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 病例介绍2
1.1病原2
1.2流行特点2
1.3临床症状2
2试验室检查2
2.1材料2
2.2 试验方法与步骤　3
2.3 PCR产物的检测4
2.4 试验结果与分析4
2.5试验结果　5
2.6 PCR产物电泳结果分析5
3 猪圆环病毒的仿制　6 3.1讨论7
致谢 8
参考文献8
猪圆环病毒的PCR诊断与防制
引言
猪圆环病毒(Porcine circovirus PCV)属圆环病毒科( Circov irdae)圆环病毒属成员,是无囊膜的单股环状负链DNA病毒, 病毒粒子直径约17~ 20 nm, 是迄今为止发现的最小的一种脊椎动物病毒[1]。90年代末 PCV的血清型2 型病毒被发现可引起猪的多系统性萎缩综合征, 该病毒因此引起国内外广泛关注[ 2~3 ]。根据PCV 致病性、抗原性及核苷酸序列的差异, 将PCV 划分成了猪1型圆环病毒( PCV1)和猪2型圆环病毒( PCV2) 两个基因[4 ] 。PCV1 广泛存在于猪体内及猪源细胞系中, 无致病性, 不能引起细胞病变; PCV2具有致病性, 在临床上除了与猪多系统衰竭综合征( post- w eaningmultisystem ic w asting syndrome, PMWS )有关外, 还可导致母猪的繁殖障碍, 断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病, 猪皮炎和肾病综合征以及猪的先天性震颤等4种疾病[ 5 ] *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
。主要以消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、生长停滞、腹泻、淋巴结先肿大后萎缩为特征[6 ]。起初人们认为猪圆环病毒可能感染奶牛、老鼠甚至人类，随后的血清学研究显示并没有任何证据说明猪圆环病毒能感染其他动物。用Ⅱ型猪圆环病毒感染兔子和绵羊结果显示该病毒并没有引起机体损伤，在血清中也没有检测到病毒存在[7 ]。流行病学研究发现一定比例的病例的出现，即使是发病比率高达32%或55%，并不能确认该病的发生[8 ]。
1 病例介绍
猪圆环病毒病广泛分布于世界各地，我国与2000年首次发现本病。PCV2感染后会出现断奶猪多系统衰弱综合征(postweaning multisystemwasting syndrome，PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，增生性坏死性肺炎（PNP），先天性颤抖和肠炎等疾病。
1.1病原
PCV2属圆环病毒科，圆环病毒属，为环状，单股DNA病毒，含1767~1768个核苷酸。已知PCV1可使部分动物红细胞凝集，耐酸，在PH3的环境下扔可存活；耐氯仿，70℃环境中仍可稳定存活15分钟。PCV2的生物学特征和理化特性可能与PCV1相似。将PCV2与双氯苯双胍乙烷，福尔马林，碘酒和乙醇等常用消毒剂在室温下作用10分钟，病毒滴度会下降。
1.2流行特点
传染源：带毒的家畜和野猪。
（1） 传播途径：口鼻接触式PCV2主要的自然感染途径。妊娠母猪感染后可以通过胎盘传染给胎儿，公猪感染后可以在静夜中检测到PCV2。
（2） 易感动物：猪。
1.3临床症状
主要表现一下2种形式。
（1）断奶猪多系统衰弱综合征：由于PCV2 的母源抗体一般可维持到6~8周龄，所以本病交易侵袭2~4月龄的猪。感染率可达100％，但发病率一般为4％~30％，死亡率为4％~20％。本病的临床症状为消瘦，皮肤桑白，呼吸困难，有时腹泻，黄疸，发病早期常出现淋巴结肿大。
（2）猪皮炎肾病综合征：本病一般侵袭仔猪，育成猪，发病率一般小于1％。最显著的症状为皮肤出现不规则的红紫斑及丘，主要集中在后肢及会阴部位，有时也会在其他部位出现，全身特征性表现为坏死性脉管炎。
2.试验室检查
2.1 材料
2.1.1猪圆环病毒
由国家兽用生物制品工程技术研究中心试验室保存。
2.1.2 仪器
DNA热循环仪，电泳仪，电泳槽，HITACHI台式离心机，紫外检测仪，PCR仪分析天平, 微波炉,1.5ml离心管架，移液器，1.5ml离心管，0.2ml离心管，枪头等。
2.1.3各种试剂
TaqDNA聚合酶（5U/uL）、10×PCR Reaction Buffer 、dNTP (25mmol/L)、引物一对，各种限制性内切酶、DL-2000Marker。
2.1.4 诊断方法
目前诊断PCV 的方法较多，大致可分为两类: 一类为血清学方法, 另一类为病原学方法。血清学方法主要为ELISA；病原学方法包括免疫酶组织化学染色法、免疫荧光法、PCR 方法。这些诊断方法中以PCR 方法应用较多。
2.2 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
试验方法与步骤
2.2.1引物设计与合成
通过NCBI搜索PCV 2 的cap蛋白DNA序列（NC—013774.4），根据此序列中保守片段设计引物P1，P2
P1: 5’-AgCgCgggCACgggTACCCggTACCgT-3’
P2: 5’- gCggAATTCggTTTTTATTCTgTCTgg-3’
2.2.2试验步骤
试验操作
(1)PCV 2 DNA抽提
DNA 抽提 取300ul保存液加入300 ul裂解液混匀, 37℃作用30 min。取上清加等体积饱和平衡酚混匀, 12000 r/ min 离心5 min。取上清加等体积酚B 氯仿B 异戊醇, 12000 r/ min 离心5 min。取上清加1. 5 倍体积异丙醇- 70℃作用30 min,4℃ 12000 r/ min 离心5 min。弃上清, 加入70% 预冷乙醇14000 r/ min 离心5 min, 将DNA 干燥后用
灭菌双蒸水溶解, 置- 20 ℃备用。
PCR反应体系（表.1-1）
无菌薄壁管中顺序加入反应体系各成分
表.1-1 PCR反应体系
Table1-1 PCR reaction system
PCR体系
组分 体积
10*buffer 10ul
dNTP 4ul
Mg2+ 1.2ul
引物 各1ul

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