猪链球菌5型的毒力分析和基因分型[20200507191840]
摘要：从临床化脓性关节炎的猪中分离得的2株病原菌，通过gdh基因检测、16s rRNA测序分析和cps血清型PCR检测，鉴定为猪链球菌5型，分别命名为HN105和Soly140101。以BALB/c小鼠为实验动物测定HN105和Soly140101的毒力，选取毒力较强的HN105进行小鼠和斑马鱼的半数致死量测定，半数致死量分别为7.07×107 CFU/mouse 和2.18×105 CFU/fish。对本实验室冻存的146株未定型猪链球菌进行cps5血清型PCR检测，共检得10株猪链球菌5型。根据猪链球菌的22种主要毒力基因设计引物，用PCR方法检测了12株5型菌的主要毒力基因，对其进行MLST分型。用纸片法测定了12株猪链球菌5型的耐药谱。为进一步开展猪链球菌5型的研究奠定了基础。
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关键字:猪链球菌5型；分离鉴定；毒力基因检测；致病性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1病料 2
1.2实验动物 2
1.3抗血清 2
1.4引物2
1.4.1独立因子引物2
1.4.2 CPS分型引物2
1.5主要试剂 4
1.6实验器材 4
1.7细菌的分离培养4
1.7.1细菌的分离4
1.7.2细菌的纯化培养4
1.8猪链球菌的判定4
1. 9血清学鉴定试验4
1.9.1猪链球菌13种血清型的PCR鉴定4
1.9.2血清凝集试验4
1.10细菌基因组（DNA）的提取4
1.10.1粗提（制备模板）5
1.10.2精提5
1.11细菌16SrDNA测序试验5
1.12动物试验5
1．12．1 细菌培养5
1．12．2细菌致病力试验5
1．12．3斑马鱼毒力试验5
1．12．4小鼠半数致死量（LD50）测定5
1.13毒力因子的检测5
1.14 MLST分型5
1.15药敏试验6
2结果与分析6
2.1猪链球的分离与鉴定6
2.2血清学鉴定试验6
2.2.1猪链球菌13种血清型的PCR鉴定6
2.2.2血清凝集试验6
2.3 细菌致病力试验7
2.4斑马鱼试验7
2.5 小鼠半数致死量（L *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
D50）测定7
2.6毒力因子的检测8
2.7 MLST分型结果8
2.8药敏试验9
3 讨论11
致谢12
参考文献13
附录A 13
附录B 14
猪链球菌5型的毒力分析和基因分型
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种在全球范围内严重危害养猪产业的重要病原，许多国家和地区近年来均有其爆发和流行的报道[1-3]。猪链球菌的自然感染部位主要为猪的上呼吸道和扁桃体，生殖道与消化道也有存在，健康猪可能带菌而不发病[4]。它同时也感染人，属于二类动物疫病。有研究显示猪链球菌分布于多种哺乳类与鸟类中，表明了其流行病学和感染途径的复杂性[5]。
猪链球菌感染猪的报道最早见于荷兰（1951 年）和英国（1954 年）[4]。此后，猪链球菌病在所有养猪业发达的国家都有报道。猪链球菌病在猪最重要的临床表现为脑膜炎；其他临床症状，包括关节炎、心内膜炎、肺炎和急性败血症死亡等，也均有文献记载[4]。1968 年，丹麦首次报道了人体感染猪链球菌导致脑膜炎的病例[5]，此后，荷兰，英、德、法、瑞典、比利时、西班牙、加拿大、美、巴西、澳大利亚、日本、泰国、中国香港、中国台湾和中国大陆等国家和地区也陆续报道了人感染猪链球菌的病例[6~8]。目前，感染人的猪链球菌有2、4、5、14、16、24这六个血清型[9]。
2014年3月，瑞典报道了一例农场主感染猪链球菌5型引发化脓性关节炎，经过反复的药物治疗和手术治疗才使病症得以缓解。同年5月，美国报道了第二例人感染猪链球菌5型引发的关节炎的病例。对致关节炎型猪链球菌5型菌应当加以重视。本试验将对经临床化脓性关节炎发病猪的关节液中分离得的2株猪链球菌5型菌进行分离、纯化与鉴定和毒力分析，并与实验室冻存的10株5型菌一起进行基因分型试验和药敏试验，为猪链球菌5型的进一步研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病料
送检的关节液病料及实验室冻存的未定型的146株菌。
1.2 实验动物
5周龄BALB/c小鼠购自扬州大学实验动物中心，斑马鱼购自中国水产科学院珠海水产研究所。日常饲养及动物实验地点为大学实验动物中心。
1.3 抗血清
由中国动物卫生与流行病学中心提供的猪链球菌参考阳性血清（1至34型及1/2型）。
1.4 引物
PCR试验引物由INVITROGEN公司合成。
1.4.1 毒力因子引物 参照文献[10-11]中的猪链球菌的gdh基因以及21对毒力因子的引物序列。引物序列见表1。
表2毒力因子引物列表
Table 2 Primers for Virulence gene
基因 Gene 5‘-3’序列 Sequence(5-3)a 产物大小（bp） Product size(bp) 退火温度(℃) TM(oC)
毒力基因 Virulence- associated gene gdh CCATGGACAGATAAAGATGG 688 54
GCAGCGTATTCTGTCAAACG  *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
r /> gapdh CGCCGCGGATCCGTAGTTAAAGTTGGTATTAAC 1040 52
GGCGCCGAATTCGTCGACATTATTTAGCAATTTTTGCG
sly GTGAAAACATGAAAGGATAAA 1099 56
CCAGATTACTCTATCACCTCA
mrp GACAGATGGTGAGGAAAATGG 1148 56
TGAGCTTTACCTGAAGCGGT
epf CGCAGACAACGAAAGATTGA 744 56
AAGAATGTCTTTGGCGATGG
fbps CCATCTTGCCAGGCTCCAC 1310 56
ACCAACGCTTCCCAGTCC
CiaRH TCCAAAATAGTTGTCTCGGGAT 1055 52.3
GCGAAGAAGTTGAACTGTTAGG
manN CAGAAAAAATTCAACTTTCCGT 908 53.6
TTACATAATTCCGAAGAAACGA
purD CGTTGCTTGGACTTTTGTGGGT 979 59.8
GACGGTGTCTGCTGTGGTGACT
dltA AGGCAGATTCAGATTCTTTAGC 1048 53.8
TCCCCAGTATGATAGGCCTGTA
rgg TGCTATATTCTGGCTATCGACC 797 52
表1 PCR引物列表
Table 1 Primers for PCR
S. suis鉴定 PCR assay 基因 Gene 引物序列(5’至3’) Primer sequence PCR产物/bp PCR product size 退火温度/℃

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/12766.html