温氏丝羽乌骨鸡羽色基因的鉴定[20200510205510]
摘要：不同品种白羽乌骨鸡白羽性状基因座不同，本文采集温氏丝羽乌骨鸡血样，采用PCR及PCR－SSCP法，结合DNA测序，分析显性白羽基因座（PMEL17基因座）和隐性白羽基因座（酪氨酸酶基因座），对温氏丝羽乌骨鸡进行羽色基因鉴定。结果表明：温氏白羽乌骨鸡白羽性状由隐性白羽基因座突变型隐性基因决定。
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关键字:丝羽乌骨鸡；隐性白羽基因；显性白羽基因；鉴定
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料和主要仪器2
1.1.1 实验样品2
1.1.2 主要仪器2
1.1.3 实验试剂2
1.2 实验方法 3
1.2.1 主要试剂的配制3
1.2.2 血样的采集3
1.2.3 血液DNA的提取3
1.2.4 DNA的浓度和纯度测定3
1.2.5 引物设计和合成3
1.2.6 PCR反应体系和程序4
1.2.7琼脂糖电泳检测4
1.2.8 变性4
1.2.9上样电泳和染色4
1.2.10样品测序4
2 结果与分析4
2.1琼脂糖电泳检测结果4
2.2 PCR-SSCP检测结果5
2.3 测序结果5
3讨论 7
3.1抗凝剂的使用 7
3.2 SSCP注意的事项 7
3.3乌骨鸡白羽性状 7
致谢8
参考文献8
温氏丝羽乌骨鸡羽色基因的鉴定
引言
鸡的羽毛颜色与色素分布、含量及比例有关。鸟类羽毛内的主要色素为真黑素和褐黑素。其中，真黑素为棕色或黑色，褐黑素为红色或黄色，两者都是酪氨酸衍生物。毛囊内黑素细胞是合成羽毛色素的主要场所，黑素小体是细胞内色素合成的主要细胞器。真黑素小体是椭圆形、内有丝状结构的实体，负责合成真黑素。褐黑素小体的外观有多种形状，内有囊状结构，负责合成褐黑素[1] 。
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白色羽分为显性白羽和隐性白羽。显性白羽性状由显性白羽基因（PMEL17基因）座控制，隐性白羽性状由隐性白羽基因(酪氨酸酶基因)座控制，它们位于不同的基因座。
显性白羽基因是影响鸡羽色的一个主要座位。Ruyter-Spira 等利用白羽分离群体和微卫星荧光标记技术将显性白羽基因定位到第22连锁群( E22C19W28)，距离 MCW188 微卫星标记2cm [2]。比较基因组分析结果表明，第22连锁群与人类第12号及小鼠第10 号染色体同源，它们的相同之处是编码黑素细胞特异的 PMEL17 蛋白[3]。Kerje 等进一步研究，结果发现显性白羽是PMEL17突变的结果[4]。PMEL17蛋白也称SILV 蛋白，是组成黑素小体的结构蛋白，黑色素沉积在 PMEL17 蛋白形成的丝状结构上[5]。PMEL17基因在真黑素小体早期发育过程中发挥关键作用，可促使真黑素前体由近似圆球形发育成为椭圆形[6]。显性白羽鸡是由于PMEL17基因第10外显子插入9对碱基导致该蛋白跨膜区多出3个氨基酸。
酪氨酸酶是色素细胞中色素形成过程中所必需的，在人类与小鼠，C位点被确定为酪氨酸酶结构基因座位。在鸡，C座位有三个白化等位基因，即红眼白、隐性白以及常染色体白化[7,8]，所对应的表型为全白羽而其野生型等位基因（C+）有很强的色素形成。对应的表型为全白羽而其野生型等位基因（C+）有很强的色素形成。隐性白羽基因是白化基因的复等位基因，分子生物学分析结果表明，隐性白羽鸡酪氨酸酶基因组 DNA 酶切片段不同于对照组；测序结果显示隐性白羽鸡与野生型对照组在酪氨酸酶基因外显子上不存在序列差异。进一步测序分析结果发现，第4内含子插入1个长为7.5 kb的内源白血病病毒，插入片段造成酪氨酸酶 RNA 加工出现异常，第4内含子部分片段滞留，第5外显子没有出现在转录本上，隐性白羽鸡以截短的转录酪氨酸酶转录本为主，含有少量正常长度的转录本，因而细胞内酪氨酸酶活性降低。
李碧春主编的教材《动物遗传学》有这么一段表述“以乌骨鸡的三对性状为例，羽色白羽（I）对有色白羽(i)为显性”[10]，它认为乌骨鸡的白羽为显性白羽，然后温氏公司的丝羽乌骨鸡白羽性状世代都没有出现性状分离，该公司的丝羽乌骨鸡没有跟别的品种杂交，全部自群繁育。自群繁育的结果是后代全部为白羽，温氏公司肯定温氏公司的乌骨鸡白羽为隐性白羽。本研究拟通过分子检测方法来鉴定温氏公司丝羽乌骨鸡白羽基因型，从而来进一步研究李碧春主编的教材《动物遗传学》关于乌骨鸡白羽性状的描述是否全面。
1材料与方法
1.1 材料和主要仪器
1.1.1 实验样品 由南京温氏家禽育种有限公司提供的20羽丝羽白羽乌骨鸡。静脉采取约血液，提取基因组DNA 。将DNA 样品存于-20℃冰箱中备用。
1.1.2 主要仪器
电泳凝胶成像系统：BIO-RAD 公司，美国
PCR热循环仪：BIO-RAD 公司，美国
电子天平：上海天平仪器厂，上海
高压消毒锅：上海申安医疗器械厂
电热恒温水浴锅：江苏太仓实验设备厂
紫外分光光度计：上海分析仪器三厂
低温高速离心机：Eppendorf 公司，德国
冰箱、微波炉、振荡器、冰盒等
1.1.3 实 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2# 
验试剂
琼脂糖(Agrose)：Spanish分装
硼酸、三清甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA-Na2：南京寿德试剂器材有限公司
浓HCL、氯化钠、氢氧化钠、β—巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、硝酸银，Acr, 分析纯醋酸，分析纯乙醇，甘油、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）：大学后勤公司
2×Taq PCR Mix：TaKaRa公司
DNA Marker：TaKaRa公司
绿如蓝染料：南京圆周率公司
1.2实验方法
1.2.1 主要试剂的配制
ACD抗凝剂：将柠檬酸0.489g，柠檬酸三钠1.32g，葡萄糖1.47g放入去离子水中，定容至100mL，4℃保存备用
1M Tris-HCL(PH=8)：将6.055gTris碱，加到ddH2O （双蒸水）40 mL中，将浓HCL调至PH=8，加入2.45mL调好的HCL溶液，然后定容至50mL
0.5M EDTA-Na2（PH=8）:将 9.356g EDTA-Na2，加到 ddH2O 40mL 中，将NaOH溶液调至调PH=8，然后加入2.45mL调好的NaOH溶液，定容至50mL
1M NaCL ：将29.22g NaCL加到ddH2O 40m中，定容至50mL
5M NaCL ：将14.61g NaCL加到ddH2O 40mL中，定容至50mL
DNA提取液100mL：10mL 1M Tris-HCL、10mL 5 M NaCL、10mL 0.5M EDTA-Na2、2gSDS、100uLβ—巯基乙醇、0.5gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)，混合，用ddH2O定容至100mL
30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100mLddH2O中，4℃保存
根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果：若条带只有566bp片段，则为引物对1的扩增产物，可判定该样品为有色羽基因；若条带只有255 bp片段，则为引物对2的扩增产物，可判定该样品为隐性白羽纯合子[16]；若两对引物均能扩增出产物，则是隐性白羽杂合子（表型可能为有色或白羽）[17]

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