近年来的研究表明，吸入麻醉剂对于心脏、肾脏、肺、脑等器官的缺血再灌注损伤具有保护作用，并且抗炎作用在其中发挥了重要的作用。七氟烷作为吸入麻醉剂因其在血和组织中溶解度低、诱导苏醒迅速等优点而被广泛应用于临床。而小胶质细胞是位于中枢神经系统内的巨噬细胞样细胞，在脑缺血缺氧损伤等疾病的进程中能够被激活并产生大量的炎症因子，最终导致神经元的死亡。本文采用脂多糖诱导炎症反应的方法建立小胶质细胞活化的离体模型，研究七氟烷干预对活化的小胶质细胞及相关炎症因子表达的影响，为进一步揭示七氟烷的抗炎机制、探讨七氟烷的神经保护作用提供理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试剂及来源2
1.1.2 仪器型号及厂家2
1.2 方法 2
1.2.1 建立LPS诱导的小胶质细胞活化离体实验模型2
1.2.2 实验分组2
1.2.3 确定七氟烷干预的治疗时间窗2
1.2.4 研究七氟烷是否抑制炎症因子的表达2
1.2.5 研究七氟烷是否抑制了NFκB的活化2
1.2.6 Western blot印迹3
1.2.7 Western印迹蛋白条带积分光密度分析3
1.2.8 数据统计和分析3
2 结果与分析3
2.1 七氟烷对脂多糖诱导的小胶质细胞活化的影响3
2.2 七氟烷对脂多糖诱导的活化小胶质细胞中NFκB及其下游炎症因子的影响5
3 讨论 7
3．1 脑缺血性损伤和小胶质细胞的关系7
3.2 小胶质细胞活化离体模型的建立7
3.3 七氟烷干预抑制脂多糖介导的小胶质细胞的活化8
3.4 七氟烷抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化的分子机制9
致谢9
参考文献9
七氟烷对脂多糖诱导的小胶质细胞活化及相关炎症因子的影响
引言
有关吸入麻醉剂的神经保护作用及神经毒性作用的研究是 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
近年来麻醉学基础研究领域内的热点问题，虽已有研究表明吸入麻醉剂对于心脏、肾脏、肺、脑等器官的缺血再灌注损伤具有保护作用，但随着分子机制研究的不断深入，发现神经保护作用及神经毒性作用可能具有某些相同的信号通路。因此，临床上吸入麻醉剂作为神经保护剂尚无突破性进展，也无法客观评价其临床麻醉的长期安全性。七氟烷作为吸入麻醉剂因其在血和组织中溶解度低、诱导苏醒迅速等优点而被广泛应用于临床。而小胶质细胞是位于中枢神经系统内的巨噬细胞样细胞，在脑缺血缺氧损伤、炎症、免疫反应、神经元发育及神经退行性疾病的进程中发挥着至关重要的作用。因此，探讨七氟烷对中枢神经系统内小胶质细胞的影响及其分子机制为解开上述谜团提供了研究方向和理论线索。
近年来，大量的研究揭示了小胶质细胞介导的炎性反应在脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森症等病理状态过程中所起的重要作用，抑制异常激活的小胶质细胞所介导的炎性损伤，可以对中枢神经系统起到保护作用。已有的临床及实验研究表明，吸入麻醉剂能够对免疫系统产生影响并抑制炎症反应；氟烷、异氟烷预处理的脑保护作用依赖于iNOS；七氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用与其抑制脑缺血损伤后小胶质细胞的活化，减少COX2、iNOS等炎症因子表达和上游的转录因子——NFκB的活化有关。而脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）能够诱导外周血白细胞、巨噬细胞、单核细胞及中枢小胶质细胞的活化，由其建立的整体及离体炎症模型应用较为广泛。
基于以上的研究成果，我们提出假设，七氟烷能够直接抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化，并且这种影响与七氟烷对NFκB信号通路的作用有关。本研究采用脂多糖诱导炎症反应的方法建立小胶质细胞活化的离体模型，研究七氟烷干预对活化小胶质细胞及相关炎症因子表达的影响，为进一步揭示七氟烷的抗炎机制、探讨七氟烷的神经保护作用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及来源
七氟烷，Baxter公司；NFκB/p65抗体（sc372），Santacruz公司；COX2抗体（4842），CST公司；iNOS抗体（sc651），Santacruz公司；LPS（L2880），Sigma公司；ELISA试剂盒，Active motif公司。
1.1.2 仪器型号及厂家
荧光显微镜（DM LB2），Leica公司；显微镜（Q500 IW），Leica公司；电泳及转膜仪（PowerPac Basic），BioRad 公司。
1.2 方法
1.2.1 建立LPS诱导的小胶质细胞活化离体实验模型 首先在大鼠BV2小胶质细胞细胞系中探索出比较稳定的培养条件，能够使每一批细胞存活率均大于95%。然后通过探索LPS剂量效应曲线及其干预时程以探索出最适合的离体炎症模型，使得小胶质细胞在LPS作用后的存活率在50%～60%。分别取0、10、50、100、500、1000 ng/mL的LPS浓度作用于小胶质细胞，作用时程分别为1、3、5 h，更换细胞培养液后24 h取细胞培养液进行LDH释放以及Alamar blue的检测以评估小胶质细胞的死亡率/存活率。结果发现，100 ng/mL的LPS作用于小胶质培养细胞1 h，细胞的死亡率/存活率为(38.65±5.38)%/(57.87±3.92)%。此后续试验采用此浓度与作用时程。
1.2.2 试验分组 小胶质培养细胞随机分为四组，分别为control组：给予无菌生理盐水+95%空气+5%二氧化碳；sham组：给予无菌生理盐水+92.6%空气+2.4%七氟烷+5%二氧化碳；vehicle组：与溶于生理盐水的LPS孵育+95%空气+5%二氧化碳；sevo组：给予LPS+92.6%空气+2.4%七氟烷+5%二氧化碳。
1.2.3 确定七氟烷干预的治疗时间窗 在加入LPS或无菌生理盐水1、6、12和23 h后，给予七氟烷干预1 h。在加入LPS或无菌生理盐水24 h，采用罗氏公司的试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放以评价细胞的死亡率，并用Alamar blue的方法检测细胞存活率。结果显示LPS诱导了BV2小胶质细胞的活化、造成细胞死亡，七氟烷干预组在加入LPS后1、6、12和23小时均较相应时间点的vehicle组显著降低细胞死亡率（p＜0.01或p＜0.05），而与之对应的是细胞存活率的升高（p＜0.05，图1、2）。各时间点之间无统计学差异，但是在加入LPS后1小时后给予七氟烷干预，小胶质细胞的死亡率/存活率vehicle组为42.34±4.29%/53.62±5.45%，而sevo组小胶质细胞的死亡率/存活率分别为29.17±3.74%/71.71±4.85%。因此，后续实验采用此时间点进行七氟烷干预。
1.2.4 研究七氟烷是否抑制炎症因子的表达 在加入LPS后24 h，收集细胞培养液及细胞，离心后取沉淀物并且提取胞浆蛋白，采用Western blot方法检测炎症因子iNOS、COX2的水平。

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