：本试验以K88+产肠毒素大肠杆菌为研究对象，构建其主要毒力基因eltA、flhD、fimA和faeG启动子的lacZ报告质粒，通过电转化法导入至ETEC K88ac△LacZ缺失株构成重组株。利用b-半乳糖苷酶与ONPG的显色反应监测它们在细菌感染IPEC-J2细胞前后表达含量的差异。之后用qRT-PCR验证LacZ报告质粒法的准确性，并用western-blot技术监测蛋白水平的表达变化。结果三者趋势一致，感染细胞后fimA、flhD的表达含量显著下降，eltA的表达含量显著上升，faeG的表达无显著影响。表明LacZ报告系统可以作为廉价而简便的方法监测ETEC毒力因子的调控，同时也为进一步阐述K88+ETEC在体内致病过程提供了理论基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
研究一 猪源产肠毒素大肠杆菌eltA、flhD、fimA、faeG基因重组报告质粒的构建和ETEC K88ac△LacZ缺失株的构建 2
1 材料和方法 2
1.1 菌株、质粒 2
1.2 培养基、主要试剂及设备 2
1.3 eltA、flhD、fimA和faeG启动子位置的预测 2
1.4 引物设计 2
1.5 eltA、flhD、fimA和faeG启动子的克隆 3
1.6 报告质粒的构建 3
1.7 ETEC K88ac△LacZ缺失株的构建及鉴定 3
1.71同源重组和LacZ缺失突变株鉴定引物设计: 3
1.72 ETEC K88ac△LacZ缺失株的构建 3
1.8 毒力基因启动子活性的鉴定 3
2 结果 4
2.1 eltA、flhD、fimA和faeG启动子的预测 4
2.2 eltA、flhD、fimA和faeG 基因启动子PCR扩增结果 4
2.3 重组报告质粒的鉴定 4
2.4 ETEC K88ac△LacZ缺失株鉴定 5
2.5 报告质粒的活性检测 5
研究二 检测IPECJ
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2细胞对于K88ac毒力因子表达含量的影响 6
1 材料和方法 6
1.1 菌株、细胞系和抗体。 6
1.2 培养基以及主要试剂 6
1.3 主要仪器 7
1.4 通过LacZ报告基因的方法从转录水平检测K88ac+主要毒力因子 7
1.4.1 IPECJ2细胞的复苏、培养和传代 7
1.4.2 IPECJ2细胞的黏附 7
1.4.3 β半乳糖苷酶显色反应监测基因启动子的表达情况 8
1.5 实时荧光定量PCR法从转录水平检测K88ac+主要毒力因子 8
1.5.1 设计毒力因子的上下游引物 8
1.5.2 IPECJ2细胞的黏附 8
1.5.3 TRIZOL法提取细菌RNA 9
1.5.4 基因组DNA除去反应和RNA的反转录 9
1.5.5 PCR鉴定cDNA 10
1.5.6 qRT PCR 反应 10
1.6 Westernblot法从蛋白表达水平检测K88ac+主要毒力因子 11
1.6.1 样品的制备 11
1.6.2 Western blot检验 11
2 结果 12
2.1 LacZ报告基因法检测试验结果 12
2.2实时荧光定量PCR分析实验结果 13
2.3 Westernblot法检测蛋白表达的结果 13
3 讨论 14
致谢 15
参考文献 15
K88+产肠毒素大肠杆菌致病机理的研究
引言
引言
产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是可以导致人类和初生幼畜腹泻的重要病原体。初生幼畜被ETEC感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,给养殖业带来严重的经济损失[1]。
ETEC的主要毒力因子包括耐热肠毒素、不耐热肠毒素、黏附素（K88、K99、F18、987P）等[2]，其中K88是最流行的菌毛粘附素[3]。我们通过在体外将细菌与肠上皮细胞共孵育，模拟宿主与病原接触的环境，分别从转录水平和蛋白水平分别监测和验证K88+ETEC的4个主要毒力因子（LT毒素，K88菌毛、鞭毛[4]以及I型菌毛[56]）的表达变化。为进一步阐释K88+ETEC体内致病过程提供理论基础。此外，我们在转录水平的检测中同时使用了LacZ报告基因[79]的方法和荧光定量的方法，通过后者验证了前者的准确性，为建立ETEC毒力监测平台中，提供廉价而简便的LacZ报告方法。
研究一 猪源产肠毒素大肠杆菌eltA、flhD、fimA、faeG基因重组报告质粒的构建和ETEC K88ac△lacZ缺失株的构建
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒
LacZ 报告质粒pRS551,猪源ETEC C83902 (K88ac+)和阳性对照pUC19lacZ为本实验室保存；感受态细胞和载体pEasyT1 simple购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 培养基、主要试剂及设备
胰蛋白酶、酵母提取物购自Oxoid 公司；琼脂、ONPG 购自上海生物工程有限公司；ExTaq（10 U/L）、dNTP、T4 DNA 连接酶均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Trans2K plusⅡ DNA Marker 购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3 eltA、flhD、fimA和faeG启动子位置的预测
根据本实验室测序已知的fimA 、flhD 、eltA和faeG基因序列，结合文献介绍基因在相关操纵子中的表达顺序，在NCBI通过BLAST获得GenBank上同源序列及上游序列备用于启动子分析。
1.4 引物设计
根据上述预测的启动子所在区域序列，取最大范围包含所有疑似启动子信号序列，设计相关引物（见表11）。引物由上海基康生物技术有限公司合成。
表11 eltA、flhD、fimA和faeG启动子引物序列和扩增片段大小
gene
Primer
Tm(℃)
Length(bp)
eltA
F:GAATTC CAACATACCTCAAAC
58
910
R:GGATCC TATAATGGCGATGCT
flhD
F:GAATTC AAGCATCGGCGCGGCTAATT

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