：牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea，BVD），是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种急、热性传染病，其临床症状以黏膜发炎，糜烂，坏死和腹泻为特征。由于临床症状及致病机理复杂，其给集约化养殖产生巨大的威胁，造成巨大的损失，而我国目前的疫苗保护力低，故找出一种快速高效的检测手段显得至关重要。本文通过对4017个样品的检测发现，ELISA是一种检测BVDV抗体水平和潜伏感染情况的良好技术，通过这种技术，以期为优化牛病毒性腹泻的防治提供一定的参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1样品采集 2
1.2.2实验前准备 2
1.2.3初检流程 3
1.2.4复检操作 4
2结果与分析 4
3讨论 4
致谢6
参考文献6
附录7牛病毒性腹泻的检验检疫
引言
随着我国经济的发展和人民生活水平的不断提高，对牛肉的需求日趋增高，牛的集约化养殖以及对牛肉的进口应运而生，而牛传染病的相关诊断防治工作也逐渐成为了一大难题。有研究表明，牛病毒性腹泻在近年来的情况不断加重，且在规模化养殖场中的发生率明显要高于散户，给我国养殖业带来了巨大的经济损失[1]。
牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea, BVD），是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea Virus, BVDV）引起的一种传染病。牛病毒性腹泻病毒为单股正链RNA病毒，直径50～80 nm，有囊膜，属于黄病毒科，瘟病毒属[2]，与羊边界病毒及猪瘟病毒在血清学上存在交叉反应。该病毒于1946年在纽约州首次发现，于1957年被首次成功分离，于1971年被命名为“牛病毒性腹泻～粘膜病病毒”。由于能够交叉感染，该病毒除了能感染牛，同时还能感染猪、羊及其他反刍动物，近年来甚至有人被感染的报道[3]。目前该病已呈世界性分布，我国首次出现该病毒是在1980年，是从国外引进的奶牛及绵羊体内
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分离得到[1]。国际兽医局将该病定为B类传染病，我国也在进出口检疫中将其定为二类传染病。
牛病毒性腹泻病又称粘膜病，该病常年可发，以冬、春季多见，呈地方性流行。感染的牛存在多种临床症状，会出现高热，白细胞减少，下痢，结膜炎，口腔黏膜充血，溃疡等症状，孕牛可能出现流产、产死胎和畸胎等。此外，该病还可以引起持续性感染、免疫耐受及免疫抑制等症状[4]。其发病机理为病毒侵入牛呼吸道及消化道黏膜上皮细胞，在其胞内进行复制，然后进入血液形成病毒血症，后经过淋巴管进入淋巴组织，导致淋巴细胞坏死，从而损害脾脏和集合淋巴结等淋巴组织[5]。故而上皮细胞变性及坏死所形成的糜烂也是该病的一大特征[3]。
酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）技术是于20世纪70年代问世的一种微量物质固相免疫的测定方法。其原理是将抗原或抗体结合到固相载体的表面，把受试样品与酶标抗原或抗体及固相载体表面的抗原或抗体反应，通过加入底物显色后的颜色反应来进行定性或者定量分析。由于抗原抗体反应的特异性及酶的高催化的效率，使得该方法特异性高，敏感性强并且迅速，特别适用于大通量样品的检测工作[6]。国外的SaLiki[7]等利用 ELISA 原理建立了检测BVDV特异性抗体技术，敏感性和特异性都十分高；我国的王新华[7]等也利用 ELISA 技术建立了一种简便有效的检测特异性抗体的方法，快速敏感且易重复[8]。
由于持续性感染牛只是易被忽视的病毒宿主，其在传播BVDV过程中具有重要的作用，健康牛群中如存在持续性感染牛其发病率会普遍增高[9]。而目前相关疫苗的保护力低[10]，防治该病的主要途径为切断传染源。故而找出一种快速高效的检测手段显得至关重要。本文通过对4017个样品的检测发现，ELISA 因其特异性高，敏感性强且迅速的优点，是一种检测牛只BVDV感染情况的良好技术[11]。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物：4017只澳大利亚进口肉牛，
实验器材：采血针，一次性真空采血管，标签，保温盒，冰箱，冰袋，离心机，超净工作台，移液枪，IDEXX牛病毒性腹泻病病毒抗原检测试剂盒，蒸馏水，多道微量移液器，试管，EP管，量筒，96孔酶标分析仪，洗板机，盖板，微量板振荡器，37℃温箱，加样槽，75%酒精，计时器，超净工作台。
1.2 方法
1.2.1样品采集
待检牛群进行编号并进行颈静脉采血，所采血样保存于一次性真空采血管中并进行编号（1～4017），置于4 ℃冰箱储存。待样品采集完毕后，将样品分组包好置于保温箱中带回实验室。
将采血管置入离心机，配平后以8000 r/min速率进行离心。离心后用一次性吸管及移液枪将血浆分装入1.5 mL的EP管中并做好标记，分装时应在超净工作台内进行。血浆分装完毕后置于4 ℃冰箱进行保存。
1.2.2实验前准备
将枪头装盒并进行高压灭菌。调整多道微量移液器，确保每道均可正常使用。取出样品并将其恢复至室温待用，为方便后续实验操作可将其先摆放成12乘8的排序并于最后空出四格。由于所需检测量大，ELISA过程中，孵育所需时间短，因此需对样品分批进行检测，4块板为一组，共11组。每组编号仍为连续编号。
于IDEXX牛病毒性腹泻病病毒抗原检测试剂盒中，依次取出所需相应数量的微量反应板（共44块）编号待用，取出所需试剂，将其回复至18～26 ℃ 并通过轻涡旋、旋转混合均匀备用。
配置洗液，将10倍浓缩的洗涤液恢复至18～26 ℃ 后可进行配制。将其用蒸馏水于洗液瓶中稀释10倍。将洗液瓶安装至洗板机上后，对洗板机进行3次润洗。同时观察洗板机的洗涤孔是否有堵塞现象，保证其能正常使用。同时将酶标分析仪开启，将其预热后进行正常工作。
1.2.3初检流程
取微量反应板并将样品序号标记在相对应的记录表上，将所需使用的试剂按顺序分别倒入酒精消毒过的加样槽中。
用多道微量移液器在每个反应孔中加入50 μL的检测溶液。最后四个孔应空出，标记为阴阳对照孔，并在阴性对照的两格孔中各加50 μL的阴性对照；在阳性对照的两个孔中各加50 μL的阳性对照；在剩下的反应孔中分别加入50 μL的被检样品，在加入不同种试剂以及样品时应每次更换枪头。完毕后将微量反应板放置于微量板振荡器震荡3 s，使反应板中溶液混匀。盖上盖板之后将微量反应板置于37 ℃的条件下孵育2 h误差不可超过5 min，孵育过程中进行下一块板的加样操作。
孵育完毕后将微量反应板置于洗板机内，每个反应孔加入约300 μL的洗涤液进行洗涤，共洗涤5次。最后一次洗涤完后，取出微量反应板并将反应板在吸水性材料上用力拍干，每块板洗涤过后都应使用新的吸水性材料进行拍干。在加入下一步试剂前应防止微量反应板干燥。

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