为调查上海地区猪丹毒丝菌的潜在感染情况，本实验对2015年度来自上海地区的两家生猪屠宰场共计60份猪扁桃体样本进行猪丹毒丝菌检测。经细菌分离培养、形态学及培养特性观察共分离获得29株疑似猪丹毒丝菌样本。结合生化鉴定及针对16S rRNA建立的特异性PCR检测，共获得16株阳性样本。该16株阳性样品的测序结果经与NCBI数据库比对确认为猪丹毒丝菌，因此，该批样本中猪丹毒的检出率为26.67%，可见上海地区健康猪群中的猪丹毒仍存在一定程度的隐性感染，提示养殖人员须给以一定关注。Student majoring in Veterinary Pharmacy Tutor PAN Zi-haoAbstract: To investigate the epidemic of Erysipelothrix rhusiopathiae in Shanghai are, 60 pig tonsils samples from two pigs slaughterhouses were collected to isolate the Erysipelothrix rhusiopathiae . A total of 29 Erysipelothrix rhusiopathiae samples were isolated by Bacterial morphological examination and bacterium separation technology. Additional, physical and chemical tests and 16S ribosomal (r) RNA sequencing identified the 16 positive samples. The results of BLAST have matched the genes of Erysipelothrix rhusiopathiae. The case detection rate is 26.67%, showing that the pigs in Shanghai are bear poison or recessive infection, suggesting that the data of this epidemic should be giv
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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.2方法 1
1.3主要仪器设备1
1.4细菌分离培养2
1.4.1样品前处理2
1.4.2预增菌2
1.4.3细菌分离2
1.5镜检2
1.6生化检验 2
1.7分离菌株PCR鉴定及测序2
1.7.1引物设计2
1.7.2核酸提取2
1.7.3 16s rRNA扩增2
1.8 16s rRNA序列分析3
1.8.1PCR产物的回收纯化3
1.8.2载体连接及测序3
1.8.3序列分析3
2 结果与分析4
2.1细菌的分离培养及形态学特性4
2.2 生化特性鉴定5
2.3 分离菌PCR 鉴定6
2.4 16S rRNA序列分析6
3 讨论7
4 致谢8
参开文献8
上海地区屠宰场样品中猪丹毒丝菌的分离与鉴定
引言
猪丹毒俗称“打火印”，是由猪丹毒丝菌引起的一种急性，热性人畜共患传染病。其病原体为革兰氏阳性的丝状或纤细小杆菌。病程可分为最急性、急性的败血型、亚急性的疹块型和慢性的关节炎及心内膜炎型。丹毒丝菌的血清型很多，现在已经报道有16种血清型，不同的血清型在毒性上的差别很大，一般从病猪分离的菌株绝大多数是血清型1a、1b 和2 型。本病广泛发生于世界各地,且一年四季均可发生，炎热多雨季节多发，各种年龄猪都可感染， 但以架子猪的发病率最高, 3 月龄以下猪很少发生, 6 月龄以上猪发病率不高, 是一种世界性分布的重要养猪业疾病。近年来国内国外各地陆续出现猪丹毒疫情并有较高的致死率，为国内养殖业造成重大损失。为了调查上海地区猪丹毒的潜在感染情况，采取上海地区两家生猪屠宰场的各30份猪扁桃体样本进行细菌分离与鉴定。
1 材料与方法
1.1 病料来源
本实验样本由上市动物疫病预防控制中心提供，样本采集自2015年上海地区两家生猪屠宰场，共计60份扁桃体样品。
1.2 主要培养基及试剂
1.2.1改良TSB培养基：TSB基础培养基中添加5%马血清，其中TSB基础培养基购自BD公司，马血清购自Thermo Fisher；
1.2.2 MBA平板：在葡萄糖叠氮钠肉汤中加入1%琼脂粉末，溶解后高压灭菌。待温度降至55℃时，加入2%绵羊血、5%马血清，倾注平板备用。其中葡萄糖叠氮钠肉汤及琼脂粉购自BD公司，马血清购自Thermo Fisher，无菌绵羊血购自上海闵行区诸翟无菌动物供应站；
1.2.3其他主要培养基及试剂：哥伦比亚血琼脂基础培养基为BD公司产品；DNA胶回收试剂盒购自TAKARA公司。
1.3 主要仪器设备
37℃恒温培养箱购自Thermo 公司；显微镜购自日本尼康公司；PCR仪器购自BioRAD公司；全自动细菌生化鉴定系统（VITEK 2 Compact）购自法国生物梅里埃公司。
1.4 细菌的分离培养
1.4.1样品前处理
分别剪取1cm2大小的扁桃体样本放置于无菌平皿中，用无菌生理盐水冲洗3次后用灭菌剪刀将样本剪碎至肉糜状。
1.4.2 预增菌
将处理好的样本投入装有TSB培养基的试管中，37℃恒温培养24h。
1.4.3细菌分离
取1mL预增菌液至无菌指形离心管中，1500rpm，离心30min,弃上清液。每管中加入500µL无菌生理盐水，混匀后，接种于MBA平板，, 37 ℃培养24 ～ 48h。
1.5 镜检
从MBA平板上挑取疑似猪丹毒丝菌单菌落至滴加有无菌生理盐水的载玻片上，烘干固定后进行革兰氏染色，吸水纸按压擦干后，置于10×100倍显微镜下观察细菌形态。
1.6 生化鉴定
采用全自动生化鉴定系统（VITEK 2 Compact）对29株疑似菌株进行生化鉴定，其操作步骤如下：使用无菌棉签挑取纯化的菌落至含盐水的试管中，使用VITEK 2浊度计制备麦氏度0.500.63密度均一的菌悬液；将菌悬液与GP卡置于卡槽，放入VITEK 2 Compact鉴定仪进行鉴定，约4h左右获得鉴定结果。并对疑似菌株开展凝胶穿刺实验，观察其生长状态。
1.7 分离菌株PCR 鉴定及测序
1.7.1引物设计
根据GenBank已发表的猪丹毒丝菌全基因组序列采用primer5.0分别设计一对16S rRNA引物:上游引物序列为5’CTGGCGGCGTGCCTAATACAT3’下游引物序列为： 5’CCTACCTTCGACGGCTCCCTC3’,目的片段大小为1437bp。引物序列由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.7.2 核酸提取
采用热裂解发提取细菌核酸：挑取纯培养的猪丹毒菌落至盛有100μL PBS的EP管中，充分混匀。将样品插入浮漂，置于100℃沸水浴中，热裂解15分钟。待样品冷却至室温后，12000rpm离心5分钟，上清即为待测核酸样本，核酸样本可用于直接检测，亦可置于20℃冰箱中保存备用。
1.7.3 16S rRNA序列扩增
核酸扩增的反应总体积为50 μL，其中包括： 25 μL 的PCR Master Mix，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，灭菌双蒸水6 μL。
将配置好的PCR反应液按下列反应条件进行目的基因的扩增：
预变性 94℃ 5 min；
94℃ 30S，

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