MSTN是肌肉发育的负向调控因子，其基因突变或敲除会使动物肌肉发达。CRISPR/Cas9技术是最新的基因编辑技术，具有载体构建简单和可多位点基因编辑的优点。为利用CRISPR/Cas9技术生产MSTN基因敲除兔子，本研究首先依据兔MSTN基因序列，设计特异针对第一外显子的sgRNA (sgR)，将sgR上下游引物重退火后插入到pX330载体中构建重组质粒sgR-pX330，测序验证载体构建的正确性。以sgR-pX330质粒为模板扩增Cas9、sgR的体外转录模板，并转录得到Cas9 mRNA、sgR。将Cas9 mRNA和sgR混合物通过胞质注射于单细胞胚胎中，约有80%胚胎能够卵裂，体外培养3-4天后有75%卵裂胚胎到达囊胚阶段。T7E1酶切检测和测序显示约75% sgR注射胚胎发生了基因编辑，产生了-19 bp~2 bp的插入缺失。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术在胚胎水平敲除兔子MSTN基因，为后续生产肌肉发达的MSTN基因敲除兔提供了基础。
目录
摘要 ...3
关键词 ...3
Abstract ..........3
Key words ..3
引言 ...3
1 材料与方法 ...4
1.1 实验动物 ........4
1.2 主要仪器及耗材 4
1.3主要试剂 .4
1.4 实验方法 5
1.4.1 兔MSTN靶向sgRNA设计 ....5
1.4.2 sgRpX330载体构建和鉴定 ...5
1.4.3 Cas9和sgRNA体外转录 ............6
1.4.4 兔子超数排卵和胞质注射 .....6
1.4.5 T7E1酶切与测序检测兔子胚胎基因编辑 ... 7
2 结果与分析 ...7
2.1 兔MSTN特异sgRNA设计与载体构建 ...7
2.2 体外转录Cas9 mRNA 和sgRNA ..8
2.3 胚胎水平验证CRISPR/sgR的基因编辑效率 .8
3 讨论 ...9
致谢 .9
参考文献  *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
.10
利用CRISPR/Cas9技术在胚胎水平敲除兔子MSTN基因的研究
引言
Myostatin（MSTN）属于TGFβ超家族成员，是肌肉的负调控因子[1]。MSTN基因自然突变会造成MSTN蛋白失活或表达量下降，导致人[2]、牛[3,4]、绵羊[5]和小鼠肌肉[6]发达。而在牛和绵羊[79]和小鼠[10]中，MSTN基因敲除也会导致肌肉发达。因此，使用基因工程手段敲除MSTN基因，是提高家畜产肉能力的有效方法之一。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein) 技术是近年来发展起来的第三代基因编辑技术[11]，相比于同源重组，ZFN (zinc finger nuclease) 和TALEN (transcription activation factor like endonuclease)，CRSIPR/Cas9技术具有载体构建简单、特异性高及可以同时多重基因编辑的优点。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于小鼠[13,14]、猴子[15]、猪[16]、山羊[17]、绵羊[7]和兔子[18]等模式动物和家畜的基因编辑工作。兔子是一种非常优秀的模式动物，也是我国重要的经济家畜，兔肉是我国人民肉食消费的重要组成部分之一。在兔子中，MSTN基因5’UTR区域SNP与屠宰性能相关[12]。因此本研究拟利用CRISPR/Cas9技术在胚胎水平敲除兔子MSTN基因，为进一步研究MSTN基因敲除兔奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本研究选择江苏省金陵种兔场6月龄健康的新西兰大耳兔作为供体兔。
1.2 主要仪器及耗材
显微操作系统（日本，Narishige）
CO2培养箱（Thermo，3111）
超净工作台（苏净集团）
高速冷冻离心机（Eppendorf，5417R）
紫外分光光度计（Thermo，Nanodrop 2000）
自动凝胶成像分析仪（FUJIFILM，LAS4000）
PCR仪（BioRad, T100）
匀浆机（ART，D9）
全波长酶标仪（Thermo，1510）
60 mm、35 mm培养皿（Nunc），6孔培养板（Axygen）
1.3 主要试剂
血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根，DP304)
PCR产物及DNA片段纯化试剂盒 (广州东盛，N1091)
MEGAshortscript™ T7 Transcription Kit (Ambion, AM1354)
mMESSAGE mMACHINE® T7 ULTRA Transcription Kit (Ambion, AM1345)
MEGAclear™ Transcription CleanUp Kit (Ambion, AM1908)
Lipofectamine® 2000转染试剂 (Invitrogen, 11668019)
REPLIg Single Cell Kit（Qiagen, 150343）
无内毒素小量质粒提取试剂盒（Omega, D695001）
pMD19T（TaKaRa, 6013）
Premix Taq TaKaRa, RR003A）
T7 Endonuclease I (NEB, M0302L)
FastDigest BpiI (Thermo, FD1014)
DMEM（Gibco, C11965）
DFBS（Gibco, 10099141）
DPBS（Gibco, 14190250）
TCM 199（Gibco, 11150059）
LH 、FSH（浙江宁波三生药业有限公司）
Hepes（Sigma, cat. no.H3375）
BSA（Sigma, cat. no. A3311）
石蜡油（Sigma, cat. no.M8410）
1.4 试验方法
1.4.1 兔MSTN靶向sgRNA设计
依据兔子MSTN基因第一外显子序列（Gene ID: 100125998），依据GN19NGG选取一条sgRNA，命名为sgR（表1）。
表1 兔sgR序列
Table1 Sequences of sgR
靶位点

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