本实验旨在研究热应激对鸡胚胎期骨骼肌发育的影响。试验选取健康的种蛋150枚，随机分为2组（常温组与高温组）每组随机分为3个重复，每个重复20枚受精种蛋。将种蛋于同一常温孵化器中常温孵化至第10天，孵化温度保持在37.5℃，箱内相对湿度维持在60%。此后，于孵化的第11天至出壳，常温组种蛋在原孵化器中继续按以上条件孵化，而将高温组种蛋转入另一孵化器中，孵化温度自升至39℃，箱内相对湿度维持在60%。三个重复分别在孵化的第13天，第16天，第21天进行采样。结果显示热应激不影响13胚龄，16胚龄，21胚龄鸡胚胸肌，腿肌的相对重量（P>0.05）。高温组13胚龄鸡胚胸肌中的Myog,Pax7基因在胸肌中的表达量及Myog/Myod值均显著低于常温组（P<0.05）;但其Myod基因在胸肌中的表达量与常温组比较接近（P>0.05）;高温组16胚龄鸡胚胸肌中的Pax7基因表达量显著高于常温组（P<0.05），但其Myod，Myog基因在胸肌中的表达量及Myog/Myod值与常温组比较接近（P>0.05）;高温组21胚龄鸡胚胸肌中的Myod基因表达量显著低于常温组（P<0.05），而Myog/Myod值显著高于常温组（P<0.05），Myod与Pax7基因的表达量与常温组无差异（P>0.05）。由此可见，39℃的热应激条件对鸡胚胎期骨骼肌重量的发育无影响，但与Myog/Myod相对丰度比值有正相关性。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1种蛋的来源与保存4
1.2主要仪器 4
1.3主要试剂4
1.4试验设计与处理4
1.5种蛋的孵化与管理4
1.6样品的采集与处理5
1.7基因的提取与分析5
1.7.1RNA的提取5
1.7.2RNA浓度测定5
1.7.3RNA反转录 5
1.7.4定量PCR5
1.8统计分析5
结果与分析5
讨论8
结论9
致谢9
参考文献10
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/> 热应激对鸡胚胎期骨骼肌发育的影响
引言
鸡的种蛋孵化需要适宜的环境条件,其中最重要的是环境温度。胚胎对孵化温度具有一定的适应能力，在35～40.5℃的温度范围内都会有一定比例的种蛋能孵化出来。鸡种蛋的最佳孵化温度是37.8℃[1]。
在全球变暖的环境发展趋势下，禽类尤其是快速发育的肉鸡散热会比较困难，进而引起发病率和死亡率的升高，造成较大的经济损失[2]。热习服[3]是减轻肉鸡热应激的有效方法。有研究表明，早期热习服可使肉仔鸡的生长过程中获得一定的对热应激的抵御能力。在已有的研究方案中，在孵化的第10天到第18天39.6℃每天处理6 h，肉仔鸡在高温应激环境下相比于对照组能获得更高的体重[4]。不过高温孵化也有不利的影响，在衣鹏等[5]的研究表明当孵化温度超过了要求温度, 将会导致胚胎代谢旺盛, 水分产生多, 种蛋失水过多, 孵化率降低, 出雏提前。因此, 本试验进一步研究高温孵化对鸡胚发育的影响，以期为早期热习服理论提供一点实验依据。
近年来 ,人们对肌肉细胞的分化、生长、发育的分子调控,机理有了较深刻的认识。1995年Naidu等[6]指出, 螺旋一环一螺旋( bHLHbasic helix loophelix) 肌肉调节因子Myod 基因家族编码4个明显不同的肌肉特异性转录因子,分别为 Myod,Myog,Myf5 和MRF4, 这些转录因子代表控制骨骼肌生成很多方面的关键调节因子。其中，MyoD 基因不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化, 而且能把许多种类型细胞( 如成纤维细胞、脂肪细胞等) 转化为成肌细胞, 并可促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维。在肌肉特异性基因转录调控中起着总开关的作用。Myog 是生肌调节因子家族中最重要的一员, 调控着中胚层细胞分化为成肌细胞, 再由成肌细胞融合为肌纤维这一过程。Myog 基因是 MRFs 基因家族中唯一在所有骨骼肌肌细胞系中均可表达的基因[7]，本实验通过测定这两个基因在胸肌腿肌上的表达量来分析热应激在基因水品上对骨骼肌发育的影响。Pax7基因属于Pax基因家族的III组,与中枢神经系统和骨骼肌的发育有关, 是强有力的生肌性诱导物, 能使多能干细胞转变为生肌性细胞, 在骨骼肌的发育和再生过程中起着至关重要的作用。
目前，较常用的肌纤维分类方式是根据所含的酶系及其活性特点，将肌纤维分为四种：慢速氧化型肌纤维（Ⅰ），快速氧化型肌纤维（Ⅱa），中间型肌纤维（Ⅱx）,快速酵解型肌纤维（Ⅱb）,SakumaK[15]通过 Westernblot 分析认为:快肌纤维与慢肌纤维相比 ,MyoD 比 Myf5 在蛋白水平增高明显,而慢肌纤维中 Myogenin 蛋白具有最高的水平 。MyogeninmRNA 主要在 Ⅰ 型表达, MyoDmRNA 主要在 Ⅱ型表达。徐林等[14]表明肌肉中氧化型肌纤维比例越高，肌肉肉质越好。肉质主要评价指标有：肉色、pH、嫩度、系水力、口感风味等。
本实验在孵化的第11天到出壳期间，将实验组种蛋的孵化温度调整为39℃，通过对实验组和对照组不同胚龄的胸肌腿肌进行称重，分析。并通过测定胸肌，腿肌的肌调节因子Myod，Myog,Pax7三个基因的表达量及Myog/Myod相对丰度比值，来研究热应激在基因水品上对鸡胚骨骼肌发育是否具有显著性影响。
1 材料与方法
1．1 种蛋的来源与保存150枚苏垦草鸡受精种蛋所有种蛋均来自同一周龄的母鸡。种蛋入孵前保存在蛋库中，种蛋库温度为12～15℃，相对温度为75%～80%，并在一周之内入孵。
1．2 主要仪器 高速冷冻离心机(Eppendorf)；生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司）；实验室用可实现温度、湿度、通风和翻蛋的自动控制的孵化箱；定量PCR仪（96孔）；RNA反转仪；超低温80℃冰箱（Thermo,USA）；冻存管；可调式微量移液器（ThermoF2）
1. 3 主要试剂 DEPC;Trizol;RNA反转录试剂盒（购自宝生物工程有限公司）；异丙醇；氯仿；cMYOD,cMYOG基因上下引物；
1．4 试验设计与处理
本试验采用单因子安排的完全随机试验方案。设常温孵化组（37.5℃）和高温孵化组（39℃）2个孵化温度处理。每个处理3个重复，每个重复20枚受精种蛋。
1．5种蛋的孵化与管理 将2台孵化箱经彻底清洗后，再用甲醛30 mL和高锰酸钾15 g对孵化箱进行熏蒸消毒。所有种蛋经0.2%高锰酸钾溶液浸泡消毒后，于同一孵化器中常温孵化至第10天，常温孵化箱设定温度（蛋壳温度）和湿度分别设定37.5℃和50%。入孵前，于每一枚种蛋的上下端做标记序号，并记录种蛋入孵重。于孵化第6天对所有入孵种蛋进行照蛋，剔除死胚蛋和未受精种蛋。将剩余的148枚暂时发育正常的受精蛋，随机分为A组（常温组)和B组（高温组），A组73枚，B组75枚，在孵化的第11天至出壳期间，常温组种蛋在原孵化器中继续按以上常温条件孵化，将高温组种蛋孵化箱温度调整为39℃，箱内相对湿度维持在60%。孵化过程中，每2 h翻蛋1次，翻蛋角度为90°，观察并记录孵化温度和湿度，并每隔2天对孵化箱的水槽加水，保持箱内湿度。
1．6 样品的采集与处理 在种蛋孵化的第13日龄，在高温组和常温组随机各抽取20枚种蛋进行采样。首先测量蛋重并记录，取出鸡胚，对鸡胚（去除卵黄囊）进行称重并记录。采集双侧胸肌，双侧腿肌，并进行称重记录，同时采集心，肝，脑，血液样品。将胸肌，腿肌样品分为2份，1份用于PCR定量分析，另一份用多聚甲醛侵泡处理，用于制作石蜡切片。所有样品保存于80℃，防止组织中的RNA降解。种蛋孵化第16日龄，再同上部操作对鸡胚进行样品采集和处理。在孵化种蛋的第21日龄，进行第三次样品采集。由于在孵化第21天，鸡胚陆续出壳，因此蛋重数据无法测得，其他数据采集工作正常进行。
1. 7 基因提取与分析

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