肥胖对受精和胚胎发育的影响
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验动物 4
1.2抗体和化学药品 4
1.3免疫荧光染色4
1.4数据分析4
2结果与分析4
2.1肥胖模型构建成功4
2.2受精率和二细胞胚胎发育率无显著变化 5
2.3肥胖导致四细胞、桑椹胚和囊胚的胚胎发育率降低 5
2.4肥胖影响小鼠二细胞胚胎的表观遗传修饰水平 6
3讨论6
致谢7
参考文献7
图1 肥胖小鼠模型5
图2 对照组和处理组体重统计5
图3 早期胚胎（合子、二细胞）5
图4 早期胚胎（合子、二细胞）发育率5
图5 早期胚胎（四细胞、桑葚胚和囊胚）6
图6 早期胚胎（四细胞、桑葚胚和囊胚）发育率6
图7 H3K27me3免疫荧光染色结果6
图8 H3K4me2免疫荧光染色结果6
肥胖对受精和胚胎发育的影响
引言
引言
肥胖在当今适龄生育女性中越来越普遍。基于它的发病机制，肥胖可分为日粮诱导型、基因突变诱导型或其它疾病诱导的肥胖。有实验证明，高脂饲粮诱导的肥胖与生殖系统问题有关，如不孕、胚胎附植障碍、流产、先天性胚胎畸形、后代肥胖和代谢紊乱等[14]。一项之前的研究强调了母亲的最佳体重和怀孕前营养对后代的重要性，母亲肥胖甚 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072&
至对合子和附植前胚胎有不利的影响[5]。这一观点被进一步证实，如果用捐献的卵母细胞代替自体卵母细胞，肥胖女性的怀孕失败率则降至正常水平[6]。
肥胖会影响黄体数量和类固醇合成急性调节酶的表达，促进卵泡闭锁凋亡[7]。过去有关高脂饲粮诱导型肥胖的研究表明，肥胖小鼠有更多的凋亡卵泡、更少的成熟卵泡和更小的胚胎[8]，并且肥胖小鼠的卵子纺锤体呈现不正常的碎片化、染色体成簇[9]。此外，脂质堆积、内质网应激、线粒体损伤和细胞凋亡等现象在高脂日粮饲喂小鼠的卵母细胞中显著增加，并且这些小鼠更有可能发生排卵停止和在体受精率减少[10]。在高脂饲粮诱导型肥胖小鼠中，还发现囊胚存活率减少，胚胎细胞异常分化等现象[11]。然而，目前对肥胖对于胚胎发育的影响及其可能机制的研究还很少。
表观遗传现象是基因表达的可遗传性改变，它不涉及核苷酸序列的变化。这些改变包括染色质甲基化和组蛋白或其它染色质相关蛋白的翻译后加工。DNA甲基化是表观遗传修饰的重要部分，对胚胎的正常发育至关重要[12]，环境因子相关的表观遗传信息参与了胚胎的早期发育阶段[13]。一项过去的研究显示，在高脂饲粮诱导型肥胖小鼠的卵母细胞中DNA甲基化发生改变，甚至在它们后代的卵母细胞和肝脏细胞中也发生了改变[14]。此外，表观遗传修饰还包括控制能量平衡的组蛋白修饰的改变[15]。例如，H3K9和H3K27在调控细胞有丝分裂的基因表达方面扮演重要角色[16]，H3K9甲基化也是早期附植前胚胎发育时亲本源基因组表观遗传的标志[17]。
本课题利用体重达到肥胖的小鼠MII期卵母细胞进行体外受精，检测了受精率，然后观察了早期胚胎发育率和表观遗传修饰的变化，并试图探讨肥胖影响小鼠早期胚胎发育的潜在机制。
1 材料与方法
1．1 实验动物
雌性C57小鼠从扬州购买，室内饲养，恒温（24℃±2℃），光照：黑暗（12h：12h）。小鼠不限饲，对照组饲喂正常饲粮（脂肪10g/100g），处理组饲喂高脂饲粮（HFD，脂肪45g/100g），每周称量小鼠体重并记录。肥胖标准为：（处理组体重－对照组体重）/对照组体重*100%＞20%。12周后，取体重达到肥胖的小鼠MII期卵母细胞进行体外受精，观察受精率和早期胚胎发育率。
1．2 抗体和化学药品
所有化学药品均购自Sigma Chemical Company。兔多克隆antiH3K4me2抗体和兔单克隆antiH3K27me3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体购自Invitrogen公司。
1．3 免疫荧光染色
检测高脂日粮饲喂小鼠体外受精之后的二细胞表观修饰水平的变化。首先用4%多聚甲醛室温固定30分钟，然后用0.5% Triton X100透膜20分钟。在封闭液于室温封闭1 h后取出，染色。染色液为兔多克隆antiH3K4me2抗体和兔单克隆antiH3K27me3抗体，4℃过夜，洗卵，用Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体(1:500)室温下标记样本40分钟。洗卵，将卵母细胞封片后在激光共聚焦显微镜下观察扫描。
1．4 数据分析
对于每一个处理组，实验重复3次以上。试验数据采用Excel 2003进行初步整理，数据以平均数±标准误（Mean±SEM）表示，用SPSS软件进行统计分析，采用独立样本T检验进行差异显著性检验，p<0.05认为差异显著。
2 结果与分析
2．1 肥胖模型构建成功
为了研究肥胖对受精和胚胎发育的影响，首先构建肥胖小鼠模型（图1），肥胖标准为：（处理组体重对照组体重）/对照组体重*100%＞20%。12周后，根据上述标准挑选体重达到肥胖的小鼠作为处理组。对照组小鼠体重21.19±0.19 g，处理组小鼠体重26.77±0.32 g，p<0.05（图2）。
图1肥胖小鼠模型 图2对照组和处理组体重统计
2．2 受精率和二细胞胚胎发育率无显著变化
取小鼠MII期卵母细胞进行体外受精，观察受精率和早期胚胎发育率。数据分析表明，体外受精率（对照组84.99%±6.63%，处理组78.30%±6.15%，p>0.05）和二细胞胚胎发育率（对照组95.41%±0.94%，处理组95.87%±2.14%，p>0.05）差异不显著。这表明肥胖对小鼠卵母细胞的受精和二细胞的发育没有显著影响。
图3早期胚胎（合子、二细胞） 图4早期胚胎（合子、二细胞）发育率
2．3 肥胖导致四细胞、桑椹胚和囊胚的胚胎发育率降低
处理组早期胚胎从四细胞（对照组88.63%±3.35%，处理组70.43%±2.98%，p<0.05）开始，胚胎发育率发生了显著变化，桑葚胚（对照组85.01%±4.09%，处理组67.39%±4.28%，p<0.05）和囊胚（对照组69.41%±7.39%，处理组42.10%±5.31%，p<0.05）的发育比率与对照组相比也显著降低。这表明肥胖对小鼠早期四细胞、桑葚胚和囊胚的发育影响显著。
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