脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子表达的影响
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2试剂2
1.3仪器2
1.4实验方法2
1.4.1奶牛乳腺上皮细胞的分离培养2
1.4.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化2
1．4．3奶牛乳腺上皮细胞的鉴定3
1．4．4奶牛乳腺上皮细胞的传代培养3
1.4.5细胞处理3
1.4.6乳腺上皮细胞存活率检测（MTT法）3
1.4.7 ILβ、TNFα浓度测定4
1.5统计方法4
2结果与分析4
2.1奶牛乳腺上皮细胞形态学观察4
2.2奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫组化鉴定5
2.3 LPS对奶牛乳腺上皮细胞细胞活力的影响5
2.4 LPS对奶牛乳腺上皮细胞炎症相关因子释放的影响6
3讨论 6
3结论 7
致谢7
参考文献7
图1牛乳腺上皮细胞形态观察4
图2角蛋白18免疫组化鉴定奶牛乳腺上皮细胞5
图3 LPS对奶牛乳腺上皮细胞细胞活力的影响5
图4 LPS对奶牛乳腺上皮细胞炎症相关因子(TNFα,IL1β)释放的影响6
脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子表达的影响
引言
奶牛乳腺炎是一种 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$
由病原微生物引发的炎症反应，会对人类社会造成严重的经济损失。奶牛乳腺炎是动物机体自我保护的一种机制，且是反应乳腺损伤的一种炎症[1]。其中大肠杆菌是奶牛感染临床型乳腺炎的主要病原菌，其中LPS是革兰氏阴性菌细胞壁上一种成份[2]，是一种在自然界中广泛存在的致病原，可在细菌快速繁殖或死亡时大量释放。LPS是一种高效的促炎反应因子，研究表明乳腺中大肠杆菌数量增加越快，乳腺中存在的LPS越多，就可能更快导致临床型炎症的发生[3]，奶牛乳腺对LPS的刺激非常敏感，乳腺内灌注LPS，能够促进动物机体产生急性期反应蛋白和炎症细胞因子的大量产生，诱导机体出现明显的乳腺炎症状，导致乳腺内分泌调控模式、泌乳营养代谢模式等随之改变，对乳脂、乳蛋白及乳糖的合成和含量有非常严重的影响[45]。另外大肠杆菌能引起乳腺的快速和剧烈的免疫应答反应，从而导致炎症感染症状。乳腺内感染大肠杆菌可引起全身变化，这些变化反应在血液和乳汁中，其中包括急性期蛋白LBP合成的增加、发热反应等。LPS的感染导致牛奶中胰岛素样生长因子1、IL1β、IFNγ、IL12、IL8、TNFα、LBP、sCD14、补体裂解因子C5a、乳铁蛋白、溶菌酶和脂质介质等水平的增加[6]。
细胞因子是细胞与细胞交流的关键信使分子，并与维持机体免疫自稳及病理过程的调节有关。细胞炎症因子中的白细胞介素（interleukin，IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）在奶牛乳腺免疫中起到了重要作用。其中IL1β 与 TNF具有协同效应IL1β，白细胞可以促进 IL6、TNF 及其自身的分泌，而 IL1β本身受 TNFα 诱导产生并与 TNFα 共同调节 IL6 等细胞因子的合成与分泌[7]。TNF 主要由单核巨噬细胞合成、分泌，TNF通过自分泌和旁分泌刺激单核巨噬细胞，使单核巨噬细胞产生并释放如 IL1、IL6、IL8 等炎性介质。同时TNF 具有防御和致伤双重作用，低水平的TNF即轻度感染时，TNF能加强机体的免疫应答反应，抵御病原体入侵；在严重感染时TNF大量产生、入血，对机体造成再次杀伤，并对微循环的血管内皮细胞产生巨大的破坏作用[8]。
从乳腺结构来看，乳腺上皮细胞是乳腺防御病原菌入侵的第一线[9]，在免疫应答、局部抵御、合成及分泌乳汁中发挥重要作用[1012]。目前国内外的研究人员在研究中多采用乳腺组织及乳腺上皮细胞作为研究乳房的模拟试验模型[13,14]。本试验是选择健康中国荷斯坦奶牛的乳腺组织，利用组织块接种法在DMEM培养液中培养牛乳腺上皮细胞。通过不同浓度的LPS处理乳腺上皮细胞，以探究脂多糖（LPS）对奶牛乳腺上皮细胞细胞活力和炎症反应的影响，为乳房炎的相关研究提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
从南京地区屠宰场选取泌乳期的中国荷斯坦奶牛，采用无菌技术采集奶牛乳腺组织后，将采集的乳腺组织置于含有抗生素（含青、链霉素的双抗）和培养液的瓶中，带回实验室备用。
1．2 试剂
大肠杆菌内毒素（LPS）、MTT（sigma公司）；DMEM液体培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Trypsin）、青链霉素（Gibco公司）；Betatubilin抗体（Santa Cruz公司）；RIPA蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度试剂盒、角蛋白18单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（碧云天公司）；其它试剂均为国产分析纯。
1．3 仪器
光学显微镜（Nikon YS100）光学成像系统（Nikon 80i）；凝胶成像系统（Las 4000）；CO2培养箱（SHELL/JB公司）；超纯水处理系统（Milipor biocel公司）；激光共聚焦显微镜（Leica公司）；实体显微镜（SMZ10，Nikon公司）；多波长酶标仪（Thermo Fisher公司）。
1．4 实验方法
1．4．1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养
奶牛乳腺上皮细胞的分离培养按照如下程序：
（1）外科手术法釆取乳腺组织。用含有双抗的PBS液多次冲洗乳腺组织，置于含有双抗的DMEM培养液中，运至实验室备用；
（2）在无菌条件下用含有双抗（200 U/mL）的PBS液反复冲洗乳腺组织块；
（3）用手术剪、摄将乳白色乳腺腺泡组织剪出，大小约1mm3。将剪出的组织块用含有双抗的DMEM培养液反复冲洗；
（4）将剪碎的组织块浸入含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素的DMEM完全培养基中，用吸管吸取组织块并将组织块紧密均匀的接种在培养瓶中；
（5）将培养瓶置于含有5% CO2的培养箱中倒置培养6h，取出，并缓慢加入少量的DMEM完全培养基12h后加入足量的完全培养基（将组织浸没）。以后48h换液1次，进行常规培养，待细胞密度达90%左右时纯化。
1．4．2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化
（1）从培养箱中取出原代细胞培养瓶，弃掉培养基，用含有双抗（200 U/mL）的PBS液冲洗3次；
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