1
目录
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况 1
1.2 LT的分子结构 2
1.3 LT的性质 2
1.4 LT的突变体 2
1.5 LT作为黏膜免疫佐剂的应用前景 2
2 大肠杆菌不耐热肠毒素LTB原核表达和纯化 3
2.1 材料 3
2.1.1 菌株、载体 3
2.1.2 主要试剂 3
2.1.3 培养基和溶液的配制 3
2.1.4 主要仪器 4
2.2 方法 4
2.2.1 LTA基因的突变 4
2.2.2原核表达载体pET32aLTB的构建 6
2.2.3重组质粒pET32aLTB在原核细胞中的表达 7
2.2.4表达产物Westernblot检测 8
2.2.5表达产物的纯化 8
2.3 结果和分析 8
2.3.1重组CTA1DD蛋白SDSPAGE结果 8
2.3.2重组CTA1DD蛋白的可溶性鉴定结果 9
2.3.3重组CTA1DD蛋白的纯化结果 9
3 结论 10
致谢 10
参考文献 11
 大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的表达和纯化
动物医学院 许玲玲
指导教师 冯秀丽 张元鹏
摘要：大肠杆菌不耐热肠毒素（heatlabile enterotoxin, LT）是肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）分泌的一种热不稳定肠毒素。LT能引起人和哺乳动物发生水样腹泻，但具有极强的黏膜免疫原性和黏膜佐剂活性，其无毒突变体在黏膜免疫研究中有重要作用。本实验通过PCR得到LTB基因，测序结果显示突变序列与预期一致。通过NdeI和BamHI双酶切将目的基因与pET32a表达载体连接,并使其在BL21菌株中分别成功表达，表达产物经SDSPAGE凝胶电泳和WesternBlot鉴定确认为目的蛋白， *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
通过镍柱纯化成功得到了单一的CTA1DD蛋白。本实验为LTB的原核表达和纯化提供了资料，希望能为日后LTB在黏膜免疫佐剂方面临床应用的研究提供资料。
Expression and purification of Heatlabile enterotoxin LTB
Student majoring in Veterinary Medicine Xu Lingling
Tutor Fengxiuli Zhangyuanpeng
Abstract：Escherichia coli heatlabile enterotoxin (heatlabile enterotoxin, LT) was an enterotoxin secreted by enterotoxigenic Escherichia coli (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC). LT can cause watery diarrhea occurred humans and mammals, but has a strong mucosal immunogenicity and mucosal adjuvant function, and nontoxic mutant LT play an important role in mucosa immune research. In this paper, the LTB gene were cloned through PCR, and sequence analysis showed that the sequence is correct. After double digestion with NdeI and BamHI, the gene LTB were linked into pET32a expression vectors, and successfully expressed in BL21 strains. These recombinant proteins CTA1DD were proved with SDSPAGE and WesternBlot, and were purified with Nickel column purification. The results provide reference for the research of LTB in mucosal immune adjuvant for clinical application.
Key words: Heatlabile enterotoxin; LTB; Prokaryotic expression
1 引言
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况
大肠杆菌不耐热肠毒素（heatlabile enterotoxin, LT）是由肠产毒性大肠杆（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）分泌的一种肠毒素，具有热不稳定的特性。LT是杂合寡聚蛋白，具有AB5型结构,约86 kD。其中A亚基（LTA）的大小约为约28 kD ,5个相同的B亚基（LTB）大小约11.5kD，彼此以共价键结合形成环状五聚体，以A亚基为中心，A亚基和B亚基共同构成六聚体蛋白。LT能引起人和其他哺乳动物的水样腹泻。LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性，但由于其毒性限制了LT的直接用于疫苗研制，因此目前对LT的研究热点主要在于减小其毒性和利用无毒的亚基[1]。
1.2 LT的分子结构
编码LT的基因长度为1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌质粒上，包括LTA 和LTB 2种多肽亚单位。LTA为LT的毒性部位，有A1、A2两个区域，两个区域之间通过一个二硫键和一个胰蛋白酶敏感回路连接。A1具有ADP核糖基转移酶活性，A2的羧基端插入LTB寡聚端，起到连接B亚单位的作用[2]。LTB空间结构为由5个相同单体构成的环形五聚体，中心为孔状，单体相互之间形成30个氢键和6个盐桥构成稳定结构[3]。A、B两个亚基都被合成为前体蛋白，分别带有18和21个信号肽，完成组装的地点是细胞周质[4]。

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