1狂犬病是由狂犬病病毒感染引起对人类及动物的健康造成严重威胁的人畜共患病，发病后死亡率接近100%，是一个严重的公共安全问题。全球每年有近5.9万人死于狂犬病，特别是在中国，印度等发展中国家。M蛋白作为狂犬病病毒的结构蛋白，在病毒的形态决定，转录复制及出芽过程中都起着重要的作用。同时，它还能诱导感染细胞凋亡进而影响宿主的免疫应答。深入研究M蛋白在RABV感染致病中的作用及其机制,特异性高反应性好的抗体必不可少，因此，本研究利用基因工程技术选用cvs11毒株M基因，并通过杂交瘤细胞融合制备其单克隆抗体，本研究的开展为狂犬病病毒的检测和狂犬病病毒感染的研究提供实验基础。
目 录
Abstract1
Key words1
引言1
1 狂犬病病毒cvs11毒株M蛋白克隆与纯化2
1.1 实验材料2
1.1.1 试剂，载体，菌种2
1.1.2 溶液的配制3
1.1.3 仪器设备4
1.2 实验方法4
1.2.1 cvs11M的克隆4
1.2.2 蛋白表达6
1.2.3 纯化蛋白6
2 狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备6
2.1 实验材料6
2.1.1 实验动物与细胞，试剂6
2.1.2 主要器材6
2.1.3 试剂配制6
2.2 实验方法7
2.2.1 BALB/c 小鼠的免疫程序7
2.2.2 M蛋白血清效价的测定7
2.2.3 杂交瘤细胞株的建立7
3 实验结果8
3.1 cvs11M克隆至PET28a载体8
3.2 重组蛋白的诱导表达及纯化9
3.3 三免后小鼠血清中抗体效价的测定9
3.4 杂交瘤细胞株的建立10
3.5 单克隆抗体的鉴定11
4 讨论11致谢13
参考文献13
狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备
动物医学专业学生 王茹怡
指导教师 粟硕
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oclonal antibody against RABV M protein
Student majoring in Veterinary Medicine Ruyi Wang
Tutor Shuo Su
Abstract：Rabies is a zoonotic disease caused by rabies virus infection that pose a serious threat to the health of humans and animals. The morbidity of the disease is close to 100%, which is a serious public safety problem. Nearly 59,000 people worldwide die of rabies each year, especially in China, India and other developing countries. M protein as a structural protein of rabies virus plays an important role in the morphological determinants, transcriptional replication and budding of viruses. At the same time, it can induce the apoptosis of infected cells and affect the immune response of the host.Indepth study of M protein in the pathogenesis of RABV infection and its mechanism, specific high reactivity of antibodies is essential. Therefore, in this study, the M protein of cvs11 strain was selected to prepare monoclonal antibodies which used genetic engineering technology and hybridoma cell fusion. The study was conducted to provide a basis for the detection of rabies virus and the study of rabies virus infection.
Key words: Rabies Virus cvs11M protein;Monoclonal Antibody;Hybridoma Cell Fusion;Genetic engineering technology
引言
狂犬病作为一种人畜共患病，发病后死亡率接近100%[1]。该病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属，病毒粒子呈子弹状，主要存在于患者动物的延脑，大脑皮质，小脑，脊髓等中枢神经系统中，唾液腺和唾液也有大量病毒，并随唾液排出体外。RABV主要感染患病动物的中枢神经系统，侵犯神经元，可以使所有温血动物受感染，宿主为犬，野生动物，蝙蝠等，具有嗜神经性[2]。本病经患病动物咬伤而感染，少数情况下可由病犬，病猫舔舐健康动物的伤口而感染。潜伏期较长，患者发病后的临床症状分为狂暴型和麻痹型，前期会表现出一种特殊的神情，精神沉郁，后期会致意识的模糊不清、恐水、高度兴奋、狂暴撕咬、日渐消瘦、最后大量流涎，不久后四肢麻痹，卧地不起，见水惶恐，并因中枢神经衰竭而昏迷或死亡[3]，整个病程约68天，病理组织上，以非化脓性脑炎和神经细胞胞浆内出现内基小体为主要特征[4]。
世界上超过95 %的狂犬病死亡病例发生在亚洲和非洲，其中我国疫情较为严重，我国每年狂犬病发病死亡率排全球第二，仅次于印度[5]，应当加以重视。如今随着宠物犬，猫的日益增多，已与人的生活密切相关，增加了人患狂犬病的危险，需要我们更加重视狂犬病的防控。同时为了更好的防控狂犬病，需要加大对RABV致病机制的深入研究。尽管相关预防控制措施已经有效地减少和控制了狂犬病每年的发病率，但是流行病学调查显示，中国毒株分支极为复杂，尤其是在农村地区，人狂犬病的防控仍面临着巨大挑战[6]。目前已有许多国家由于地理环境优势以及各种综合措施的应用，彻底消灭了狂犬病，而我国却一直处于一个严峻的状况，虽然人主要通过犬只咬伤感染狂犬病，但家养动物，特别是农村地区的流浪犬和野生动物的接触又使得狂犬病的流行情况更加复杂，因此若想有效地控制狂犬病的流行，研究清楚狂犬病病毒的致病机制以及建立有效的检测方法是我国控制狂犬病的更好途径[6]，对狂犬病的防控有重要的指导意义。

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