本研究根据从NCBI数据库中下载到的84条DHAV-1的VP1基因核酸序列的比对结果，设计出了一对可特异性扩增140bp片段的上、下游引物及相应的TaqMan探针，通过对引物浓度、探针浓度及退火温度的优化，建立了Ⅰ （甲）型鸭肝炎病毒1系（DHAV-1）的实时荧光定量RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了分析。结果表明，该检测方法呈现出典型的S型扩增曲线，能扩增出目的条带，其敏感性能达到1×102拷贝，批内重复及批间重复的变异系数均小于5%。同时特异性分析表明，本方法对其他七种常感染鸭的病原的检测结果均呈阴性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料 2
1.1主要仪器 2
1.2主要试剂 2
1.3模板毒株 3
1.4载体与菌株 3
2方法 3
2.1引物与探针 3
2.2标准阳性质粒构建 4
2.3荧光定量PCR反应条件优化 8
2.4特异性、敏感性与重复性检验 8
3结果 8
3.1引物选择 8
3.2最佳引物、探针浓度及退火温度 9
3.3特异性检验结果 9
3.4敏感性检验结果 10
3.5重复性检验结果 11
4讨论 11
致谢 12
参考文献 13
Ⅰ 型1系鸭肝炎病毒（DHAV1）实时荧光定量RTPCR检测方法的建立
引言
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DHV）引起的一种具有高度传染性和致死性的病毒性疾病。病鸭早期阶段会出现精神沉郁、食欲不振、行动呆滞迟缓的症状，常蹲伏于地不愿四处走动觅食，半闭眼呈昏睡状[6]。雏鸭在发病后期死亡时常伴有较明显的神经症状，如双翅下垂、双腿痉挛抽搐，头颈向后背部扭曲呈现角弓反张的姿势，剖检可见明显的肝脏的水肿、出血和坏死[7]。幼龄的雏鸭对鸭肝炎病毒极易感，雏鸭的日龄越小则死亡率越高；后期随着雏鸭日龄的增加，将会逐渐获得免疫保护，死亡率明显下降。成年鸭几乎不发病， *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
但大部分成年鸭呈隐性感染状态，可作为传染源，不断向外界排毒。因此，有必要做好针对DHV的预防和鉴别诊断工作，防止鸭病毒性肝炎的大规模爆发，减少经济损失，促进我国水禽养殖业发展。
研究发现，DHV可分为三个血清型型，即Ⅰ 型（DHVⅠ）、Ⅱ 型（DHVⅡ）、Ⅲ 型（DHVⅢ）[1]，各自的致病性、临床表现、病理特征以及流行病学特点不尽相同。目前，我国境内流行的DHV主要是I型1系毒株（DHAV1）。针对该病原现行有效且较为传统的检测手段为病原分离方法和免疫血清学方法[10]，但由于其操作步骤繁琐、耗材数量巨大、耗费时间较长且灵敏度不高，难以精确定量分析，故利用分子生物学方法建立一种高效、灵敏、特异性强且可以进行精准定量的DHAV1检测方法尤为重要。
因此本研究拟建立一种特异、敏感、稳定的实时荧光定量RTPCR方法，并应用于临床上DHAV1的检测。
1材料
1.1主要仪器
表格 1主要仪器及其品牌、型号
仪器
品牌
型号
实时荧光定量RCR仪
罗氏
LightCycler 96
PCR仪
东胜龙
二代ETC811
电泳仪
Tanon
EPS 300
全自动数码凝胶图像分析系统
Tanon
1600
台式高速冷冻离心机
Hettich
Mikro220R
微量分光光度计
Thermo Scientific
NanoDrop
隔水式培养箱
风校
GHP9050
气浴恒温振荡器
常州国宇
THZ82A
1.2主要试剂
表格 2主要试剂品牌及用途
试剂
品牌
用途
RNA isolater Total RNA Extracqion Reagent
Vazyme
病毒总RNA提取
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
Thermo Scientific
RNA反转录
Gel Extacqion Kit
QIAGEN
DNA片段回收
Mini Plasmid Kit
TIANGEN
质粒提取
dNTP Mix
ZOMANBIO
PCR
PremixEx Taq酶
TaKaRa
实时荧光定量PCR
1%琼脂糖凝胶、Trizol法中所使用到的无机试剂等常规试剂均由本实验室自行配制。
1.3模板毒株
DHAV1 A66弱毒疫苗，由成都天邦生物制品有限公司提供。
1.4载体与菌株
质粒选用的是TaKaRa品牌的pMDTM 18T Vecqor Cloning Kit；表达载体为大肠杆菌DH5α感受态细胞，由本实验室自行制备及80℃冷冻保存。
2方法
2.1引物与探针
2.1.1引物与探针设计
查阅相关文献可知，DHAV1病毒基因中VP1基因序列相对保守[3]，可用于引物及探针设计。根据所查阅文献中的遗传进化信息，从NCBI数据库中下载了84条已被收录的DHAV1的VP1基因核酸序列。通过使用计算机软件DNAMAN进行多序列比对，找出了DHAV1 VP1基因上相对保守的区域（图21）。以DHAV1 A66（DQ886445.3）为模板，运用计算机软件Primer Premier 5设计引物和探针，选取了三对引物进行初步筛选比较。以最小Cq值及最大荧光信号为筛选条件，最终确定了一对可以特异性扩增出140bp核酸片段的引物（DHAV1F、DHAV1R）和TaqMan探针（DHAV1P），引物、探针序列及其结合位点详见表3。上游、下游引物和TaqMan探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

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