副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)为革兰阴性菌，引起的疾病称为格拉泽氏病(Glässers Disease),在断奶猪群主要表现为多发性浆膜炎、关节炎或呼吸道型继发性支气管炎。因此，对副猪嗜血杆菌分离后鉴定和保藏的研究对开展药物敏感性实验和制备自家疫苗具有重要意义。本研究以江苏省农业科学院兽医研究所保存Hps XX0306、FS0307基础菌种为研究对象，通过在TSA平板上划线观察菌落形态和革兰氏染色观察细菌形态，然后应用副猪嗜血杆菌特异性PCR引物通过PCR反应鉴定确定其为副猪嗜血杆菌。琼脂双向扩散和微粒凝集试验证明其分别为血清学5型和4型且抗原效价均为1:32。菌液加蔗糖明胶保护剂经真空冷冻干燥后5次抽样复苏。复苏后的细菌菌落形态正常、细菌存活率平均为94.02%、91.92%，生物学特性未发生明显变化，表明冻干后菌株符合副猪嗜血杆菌特性，证明本次冻干效果良好。副猪嗜血杆菌成功鉴定和保藏为该菌引起的疾病的诊断、预防和治疗奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验试剂 2
1.2仪器和设备2
1.3实验方法2
1.3.1培养基的配制2
1.3.2菌落形态观察2
1.3.3细菌形态观察2
1.3.4 PCR检测3
1.3.5 血清学特性鉴定3
1.3.6 菌株的保藏4
2 结果与分析5
2.1 形态5
2.1.1 菌落形态5
2.1.2 细菌形态5
2.1.3 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳5
2.1.4 双向琼脂扩散试验6
2.1.5 微粒凝集反应7
2.1.6 冻干效果评价7
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
副猪嗜血杆菌的鉴定及保藏
引言
引言 副猪嗜血杆菌是革兰阴性菌，血清型十分复杂，目前已知的血清型有15种，但各国各地流行的血清型不尽相同，血清 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
学研究证明副猪嗜血杆菌菌群内具有高度抗原性差异，目前已知的血清型有15种[1]。其中血清型1、4、5、10、12、13、14型会导致革拉泽氏病。美国、德国、加拿大、西班牙及日本等国的血清流行病学调查证明5型和13型为主要流行的血清型[2],并且Hps不同的血清型菌株免疫后缺乏交叉保护性[3]。蔡绪旺等对我国的感染病例进行了调查研究，证明我国目前以血清型4型和5型最为流行[4]。该菌的感染对象仅为猪，通过拭子能够从患病或健康猪的鼻腔、扁桃体和气管中分离获得，是猪上呼吸道的共生菌。但通过拭子的方式常会采集到非致病性的Hps，因此通常从病死猪的心脏、肺、脑等组织或腹腔液、关节液中分离致病菌[5]。副猪嗜血杆菌的分离对于该病的确诊十分重要，但由于副猪嗜血杆菌的体外生长环境极为严苛、样本中常常混有其它菌株如巴氏杆菌、分离传代后的副猪嗜血杆菌不易存活、经过保藏后的菌株不易复苏、菌株存活率低等[6]，导致临床上难以成功分离副猪嗜血杆菌，因此易造成副猪嗜血杆菌病的误诊或漏诊等。分离和长期保藏副猪嗜血杆菌菌种为日后的菌株性质鉴定、生理性质和生化性质研究以及培养特性研究和与其它菌种的鉴别提供了便利。
1 材料与方法
实验试剂
副猪嗜血杆菌疫苗培养基，青岛日水生物技术有限公司；琼脂粉和革兰染色试剂盒来自Solarbio Life Science；琼脂糖，BIOWEST；细菌基因组提取试剂盒，TIANGEN；蔗糖，西陇科学股份有限公司；明胶，天津市北辰方正试剂厂；小牛血清，民海；NAD酶，北京中生瑞泰科技有限公司；副猪嗜血杆菌XX0306F4（批号20120110），FS0307F9（批号20120110）冻干菌株（由江苏省农业科学院兽医研究所保存）、副猪嗜血杆菌四型标准菌株SW124F316（批号20120428），五型标准菌株HS80F264（批号20120110）（由澳大利亚昆寸士兰州动物研究所Pat Blackall博士惠赠）及高免兔血清（由江苏省农业科学院兽医研究所保存）。
仪器和设备
超净工作台，苏净安泰；离心机，Thermo Scientific；显微镜，Nikon；37℃培养箱，北京福意电器有限公司；摇床，北京福意电器有限公司；PCR仪，WEALTEC；核酸电泳槽，Tanon；冷冻真空干燥机，VirTis SP Scientific；70℃冰箱，SANYO。
实验方法
培养基的配制
TSA固体培养基：精密称取14g副猪嗜血杆菌疫苗培养基，加入360mL去离子水充分溶解，溶解完全后加入6g琼脂粉，高压蒸汽灭菌，加入5mL过滤除菌的小牛血清和2mL NAD至终浓度为0.01%，混匀后倒入平皿，冷却凝固后放于4℃冰箱保存。
TSB液体培养基：精密称取35g副猪嗜血杆菌疫苗培养基，加入900mL去离子水充分溶解，高压蒸汽灭菌，加入5mL过滤除菌的小牛血清和2mL NAD至终浓度为0.01%，冷却后放于4℃冰箱保存。
1.3.2 菌落形态观察
将副猪嗜血杆菌疫苗培养基、民海小牛血清和NAD制成含1%TSA、10%小牛血清的琼脂平板和TSB液体培养基。
将副猪嗜血杆菌XX0306F4冻干菌株和FS0307F9冻干菌株及标准株接种含1%TSA的琼脂平板，置于37℃培养箱中培养1828h，观察菌落的形态。
1.3.3 细菌形态观察
在经过培养后生长出菌落的琼脂平板上挑取单一菌落，在新琼脂平板上进行划线培养，置于37℃培养箱中传代培养，生长出菌落后挑取单一的菌落制作涂片并进行革兰氏染色。
（1）涂片：在一张载玻片上滴加两滴生理盐水后，涂布菌株
固定：将制成的涂片干燥固定，通过火焰56次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜，使之迅速干燥。
（2）染色：
初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒，立即用水冲净酒精。

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