为了解南京及周边地区的禽流感病毒流行情况，于2018年9月至11月对南京市区活禽市场及周边地区的禽类进行了流行病学调查分析。共采集样品1258份，对病毒分离提取后进行AIV M基因PCR鉴定，对阳性样品进行HA基因鉴定，并把鉴定为H9亚型的流感病毒进行NA基因鉴定，并对其HA、NA基因全长进行扩增并测序，最后对所得HA、NA基因序列进行分析。结果表明1258份样品中，共检出禽流感病毒阳性样品96份，阳性检出率为7.63%，活禽市场与周边自然保护区的检出率分别为19.51%和1.78%。H9亚型禽流感病毒感染样品有67份，占流感病毒M基因阳性样品数的69.79%；对其中的22株H9亚型的病毒进行NA亚型鉴定，结果显示均为N2亚型。对其进行HA和NA基因全长的扩增和测序后，获得14株的HA和NA全长，分析结果显示HA基因相似性为92.2%～99.9%之间，对其HA基因进行遗传进化分析显示其均属于欧亚分支中的BJ/94-like亚分支。表明南京及周边地区H9亚型AIV的遗传进化相对较稳定，为进一步分析病毒变异情况和更好的防控禽流感提供参考。
目录
摘要 2
引言
禽流感（avian influenza），全名鸟禽类流行性感冒，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，可危及禽类、人类和小型哺乳动物，呈世界性的存在和发生。禽流感病毒依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同而有许多亚型[1]。目前已从禽类鉴定出15个HA亚型(H1～H15)，9个NA亚型(N1～N9)。根据致病性可分为非致病性、低致病性（Low pathogenic Avian influenza，LPAI）和高致病性禽流感（Highly pathogenic Avian influenza，HPAI）三大类。其中HPAI被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物疫病，是世界各国重点检疫和防范的对象。
我国于1979年首次分离到AIV，1994年报道AIV在鸡群中流行，1997年在香港首次发生H5N1亚型AIV感染人事件，并造成6人死亡。2013年3月31日，中国内地首次发现H7N9禽流感病毒，至5月31日，共确诊病例131例，其中39人死亡[2]。到目前为止已发生多起不同禽流感亚型感染人致人 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
死亡的事件，AIV的流行呈上升态势[3]。另有报道显示，广泛存在的H9亚型因其频繁流行和重组会大大增加出现新型流感病毒的几率[4]。禽流感不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，对公共安全也造成了极大的威胁。近年来在禽流感病毒致病性和传播性方面，我国科研工作者做出了大量的研究，利用反向遗传和定点突变等操作技术，已证实H5N1亚型禽流感病毒PB2蛋白D701N，HA蛋白裂解位点P6位的丝氨酸以及NS1蛋白P42S均与病毒对哺乳动物的致病力增强有关[5、6]。H9N2亚型流感病毒HA蛋白A316S和NA蛋白颈部氨基酸的缺失，可以增强病毒对小鼠和鸡的致病力[7]。这些研究均从分子角度揭示了突变或重组对禽流感病毒致病力和传播力的影响，并解释了其作用机制。研究结果对于预测流感的流行和毒株致病力变化，及研发新型抗流感药物和均具有重要意义。
流行病学调查、检测是通过大规模的对各地的家禽进行采样、检测、测序、分析，从而及时了解禽流感病毒的流行情况以及禽流感病毒的变异情况，分析其遗传进化的特点，达到及时制定科学的防控政策的目的。活禽市场是防控禽流感非常重要的防线，活禽交易市场中，大量不同种属、不同产地来源的禽类以极高的密度集中在一起，并且人流量巨大，为AIV的基因重排和跨种间传播提供了很好的条件[8]。若发生基因变异则可能产生对人有高致病力的禽流感病毒。因此，加强活禽市场流感病毒的流行变异趋势的监测对流感病毒的综合防控及公共卫生健康具有重大的现实意义。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1咽拭子样本
于2018年9月至11月在南京大生冷链农批市场、南方花园农贸市场、天印山农贸市场等活禽市场及盐城丹顶鹤自然保护区共采集禽类咽拭子1258份，其中鸡咽拭子282份，鸭咽拭子898份，鹅咽拭子17份，鸽咽拭子61份（见表1）。样品采集过程中均放于0℃保温箱中保存，采集完成后分类贴标签放于80℃冰箱保存。
表1 各次采集样本统计表
2018.9.25
南京周边市场采样
2018.10.13
南京周边市场采样
2018.10.17
南京周边市场采样
2018.10.25丹顶鹤自然保护区及盐城周边市场
2018.11.15
盐城丹顶鹤保护区
2018.11.22
盐城丹顶鹤保护区
总计
鸡咽拭子
97
51
130
4
0
0
282
鸭咽拭子
22
10
23
125
372
346
898
鹅咽拭子
5
0
6
6
0
0
17
鸽咽拭子
48
13
0
0
0
0
61
总计
172
74
159
135
372
346
1258
1.1.2 SPF鸡胚
911日龄的SPF鸡胚购于南京天邦生物科技有限公司，放于37℃温箱中。
1.1.3试剂
2×Taq PLUS Master Mix、LA Taq酶、反转录试剂盒（诺唯赞 Hiscript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）均购于诺唯赞公司；82 DL 2000 Marker购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit（200）琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒均购自OMEGA公司；Trizol试剂购于诺唯赞公司；86 Dured核酸染料购于那央生物公司；其他如无水乙醇、异丙醇、氯仿等均为国产分析纯试剂；氨苄青霉素、双抗、双蒸水等常见试剂由实验室提供。1%鸡红细胞的配置：用5mL注射器抽取1mL抗凝剂后抽取鸡血4mL，加入三倍体积PBS进行洗涤1500rpm转速离心5分钟后弃去上清，用PBS洗涤三遍后稀释至1%待用。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562176.html