为了建立用于猪伪狂犬病毒（PRV）gE抗体的血清学检测，本研究使用纯化的gE蛋白和HRP标记抗gE蛋白单克隆抗体确立出了阻断ELISA 方法。通过选择出的ELISA反应条件为抗原包被浓度为0.75 μg/mL，4℃包被12 h，2%明胶37℃封闭3h，待检血清未稀释，作用时间为37℃，2小时，酶标记的单克隆抗体稀释l30000，作用时间37℃，0.5 h。判定标准血清样品阻断率PI≥40.0时为阳性，PI≤30.0%时判为阴性，30%目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试剂、细胞及菌株4
1.2标准血清及样品 4
1.3包被抗原的制备与纯化4
1.4 单克隆抗体的纯化及辣根过氧化物酶（HRP）标记4
1.5阻断ELISA一般过程4
1.6.阻断ELISA最佳反应条件的筛选5
1.7判定标准的确定5
1.8阻断ELISA的重复性试验5
1.9特异性及灵敏性试验5
1.10交叉反应性试验5
1.11符合率试验5
1.12临床血清样本检测5
2.结果与分析5
2.1重组蛋白的纯化6
2.2纯化单克隆抗体6
2.3酶标抗体工作浓度的确定6
2.4阻断ELISA最佳反应条件6
2.5阻断ELISA 判定标准的确定8
2.6阻断ELISA 的批内重复性试验8
2.7阻断ELISA 的批间重复性试验8
2.8阻断ELISA *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
的特异性及敏感性8
2.9交叉反应性试验8
2.10阻断ELISA符合率9
2.11临床血清样品的检测9
3讨论与总结 9
致谢10
参考文献10
猪伪狂犬病病毒gE蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立
引言
引言：伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）又被叫做奥耶斯基氏病，属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科，主要感染牛、羊、猪等哺乳类家畜以及野生动物使其生殖系统包括神经系统受到侵害，生产性能也会相应降低，严重时引起动物死亡[1]。作为PRV的天然宿主，猪可能在任何生长状态被感染，特别是在哺乳期仔猪和妊娠期母猪中。新生仔猪一般有神经系统症状，如感染后昏厥和震颤，死亡率极高；怀孕的母猪主要是流产，死产和木乃伊胎儿；成年期猪经常出现呼吸道症状。猪伪狂犬病作为一种天然的流行病，传播途径快，途径多，难以去除病原体。目前，一些欧洲及北美国家运用高效的疾病防控程序和扑杀手段，已做到彻底净化PRV。但PRV仍在我国许多地区流行，被列为二类动物传染病，造成巨大经济损失。[2]
在我国，养猪事业必然会向着规模化、集约化的方向发展，但伪狂犬病的爆发和感染日益频繁，对我国养猪业的良好发展产生了不可忽视的负面影响。gE基因缺失疫苗，是在主要毒力基因胸腺激酶（TK）缺失的基础上将非必需糖蛋白基因进行缺失获得的双基因缺失疫苗，由此获得的弱毒突变株无法刺激动物生成抗缺失蛋白的抗体，并且对在细胞上病毒的免疫原性和增殖也不产生影响，从而以血清学方法区分开自然感染野毒和疫苗免疫，从而实现防治、净化。许多国家为了根除伪狂犬病，运用gE基因缺失疫苗与gEELISA鉴别诊断法相配合来根除此病。[3]
PRV的糖蛋白中gE是主要的毒力因子。缺失gE对体外培养病毒的免疫原性连同增殖性能不产生影响，然而会减小下降病毒毒力，因而启迪了该病疫苗的研发制备[4]。g在几乎所有分离出来的野毒株中，我们都发现了gE蛋白的存在。自然感染上了PRV，动物们的血清里面，gE抗体的含量就会相应提高，gE抗体不会由免疫后的gE蛋白缺失疫苗产生。因此，猪的野毒感染的临床检测可以选择gE蛋白作为包被抗原。
目前PRV的诊断方法多采用ELISA、病毒分离培养、PCR、免疫荧光法、琼脂免疫扩散试验、血清抗体检测等[56]。然而病毒分离培养表现出一般情况下会耗时 2~3 d 以及敏感性较差的缺点[78]。与其他检测方法作对比，ELISA的应用还是比较广泛的，因为它更加便与操作，特异性良好，也比较灵敏，而且还可以大批量的操作，临床样品的检测可以用它。适用于血清流行病学的研究，因为它能够进行批量样品。
为建立猪伪狂犬病毒(PRV)gE抗体的血清学试验，将gE蛋白纯化后，以及以HRP标记好了抗gE单克隆抗体，运用它们进行了阻断ELISA。并将该方法初步应用于临床样本的检测，以期为PRV的疫病监测、鉴别诊断和流行病学调查提供条件。
1 材料与方法
1．1 试剂、细胞及菌株
大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），PET32a均由本实验室保存。我们的实验室分离并保存PRV新流行毒株ZJ01。其他蛋白Marker、IPTG等试剂，由其他生物工程公司购买。
1．2 标准血清及样品
PRV标准阴阳性血清，猪瘟病病毒（CSFV）、猪圆环病病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病病毒（PRRSV）、猪口蹄疫病病毒（FMDV），阳性血清保存在实验室。将临床血清样品送至大型猪场进行血清样品检测。
1．3 包被抗原的制备与纯化
取于70℃冻存BL21pET32agE甘油菌复苏，通过IPTG诱导后，对细胞进行超声处理，然后以10000rpm离心10分钟，并使用上清液通过NiNTA亲和层析法纯化重组gE蛋白，并利用SDSPAGE对蛋白纯度进行分析。
1．4 单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的纯化

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