乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是一类不运动、无芽孢、能利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的革兰阳性细菌，其中许多菌种是潜在的益生菌。本研究从鲫鱼肠道中分离获得4株产酸特性较强的乳酸菌C3、C5、B1、A5，经传统细菌学鉴定和16S rRNA基因测序确定其分别为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。经过对其生长性能、产酸能力、压力耐受能力、自凝集及共凝集能力、抑菌能力等生物学特性的测定，发现菌株C5生长性能良好，能耐受10%鲫鱼胆汁及pH3.0的酸度，2 h自凝集率达15%，能与嗜水气单胞菌(Aeromnas hydrophilo)NJ-35、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)GD201008-001发生共凝集作用，并对以上两种病原菌产生有效的抑制作用。通过这些生物特性可推断C5具有作为益生菌的潜力。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 实验动物 2
1.2 实验菌株 2
1.3 试剂与仪器 2
1.3.1主要试剂 2
1.3.2主要仪器 2
1.4鲫鱼肠道内乳酸菌的分离鉴定 2
1.4.1乳酸菌的分离纯化及菌落形态观察 2
1.4.2菌体形态观察 3
1.4.3生化特性鉴定 3
1.4.4分子生物学鉴定 3
1.5鲫鱼肠道内乳酸菌的生物特性分析 4
1.5.1 乳酸菌生长曲线测绘 4
1.5.2 产酸能力检测 4
1.5.3 压力耐受检测 4
1.5.4 菌体表面疏水性检测 4
1.5.5 自凝集、共凝集能力检测 4
1.5.6 抑菌能力测定 4
1.5.7 药物敏感性分析 5
1.5.8 统计分析 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
5
2 结果与分析 5
2.1 菌落与菌体形态 5
2.2 生化特性 7
2.3 分子生物学鉴定 7
2.4 生长曲线 8
2.5 产酸能力 8
2.6压力耐受能力 9
2.7 菌体表面疏水性 10
2.8 自凝集与共凝集能力 10
2.9 抑菌能力 10
2.10药物敏感性 11
3 讨论 11
致谢 13
参考文献 14
4株鲫鱼肠道乳酸菌的分离鉴定及生物学特性分析
引言
随着水产养殖业的集约化发展，细菌感染成为制约水产养殖业发展的关键因素[1]。为防治细菌感染而过度使用抗生素导致了抗生素抗性细菌的出现，又进一步加剧了感染性疾病的暴发。因此，益生菌作为一种潜在的抗生素替代物受到了许多研究者青睐。已有报道证实，益生菌可以激发非特异性免疫，促进生长，促进维生素合成代谢，并改善水产养殖的水质[2]。目前已知的益生菌中乳酸菌占有相当大的比例[3]。
乳酸菌是一类不运动、能发酵糖类产生大量乳酸且不产气、过氧化氢酶阴性的革兰阳性菌。乳酸菌作为益生菌最早应用于食品、医药、饲料工业等领域，20世纪80年代以后，有关乳酸菌于水产养殖的报道才逐渐增加[4]。因其在使用过程中不会产生药物残留、耐药细菌、环境污染等问题，乳酸菌现已在水产养殖业中广泛应用。但目前许多商品益生菌是非鱼源的[5]。宿主源的乳酸菌具有更好的益生效益，能够与常驻微生物竞争成为优势菌种，并且能够在肠道环境中持续存在[6]。因此不少学者开始探索鱼源的乳酸菌，分别从牙鲆[7]、许氏平鲉[4]、黑鲷[8]、大菱鲆[9]等肠道内获得了益生特性良好的乳酸菌。目前关于鲫鱼肠道益生菌的研究还比较少。
鲫鱼作为我国一种重要的淡水鱼养殖品种，同样面临着集约化养殖、抗生素滥用、水体环境污染等因素导致的病害问题。为缓解这一问题，本课题从鲫鱼肠道内分离获得乳酸菌并对其进行生物学特性分析，筛选出具有潜力作为有益菌群应用于水产养殖的菌株，为其在鲫鱼养殖生产中的应用进行初步探索。
1 材料与方法
实验动物
于孝陵卫水产市场购买获得健康野生鲫鱼，鱼体长1520 cm，重3040 g。
实验菌株
嗜水气单胞菌NJ35、无乳链球菌GD201008001均来自实验室保存菌种，作为抑菌试验指示菌。干酪乳酸菌（L.casei）ATCC393(lac393)由东北农业大学唐丽杰教授惠赠，作为各乳酸菌菌株生物特性试验的参考菌株。
1.3 试剂与仪器
1.3.1主要试剂
75%酒精、pH值分别为3.0、4.5、5.5、7.4的PBS缓冲溶液、革兰染液、细菌微量生化反应管、抗生素药敏片购自杭州滨和生物试剂有限公司。DNA marker 2000、Green Taq Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。16S rRNA引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。MRS培养基、MRS肉汤培养基、THB培养基菌均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，酵母浸粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸三铵2 g，醋酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂15 g，吐温1g，加去离子水定容至1000 ml,121 ℃高压20 min分装于培养皿中，冷却后备用，用于乳酸菌的分离培养和计数，此培养基pH范围为6.06.4；
MRS肉汤培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉8 g，酵母浸粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04 g，，吐温1g，加去离子水定容至1000 ml,121 ℃高压20 min冷却后备用，用于乳酸菌的增菌培养，此培养基pH范围为5.55.9；
THB培养基：牛肉粉10 g，胰蛋白胨20 g，葡萄糖2 g，碳酸氢钠2 g，氯化钠2 g，磷酸氢二钠0.4 g，加去离子水定容至1000 ml,121 ℃高压20 min冷去后备用，用于无乳链球菌GD201008001增菌培养；

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