3本试验用已建立的ELISA检测方法检测兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗免疫期试验家兔的血清样本，并分析不同剂量（1ml、2ml）下该疫苗对家兔的免疫效果。试验结果表明，注射2ml免疫剂量的效果更好。此外3个兔场免疫家兔体内的兔出血症病毒抗体水平普遍呈曲线上升趋势，达到峰值后略有下降的趋势；免疫家兔体内兔多杀性巴氏杆菌抗体水平在免疫2个月时达到峰值，且从峰值开始，抗体水平略有下降，总体而言较为平稳。上述试验结果表明接种疫苗免疫效价良好。本实验所采用的间接ELISA检测方法对于疫苗效力的检测具有良好的适用性，且操作简便、稳定性高、特异性强的优点，便于临床大批量的血清样本检测。
目录
引言
兔病毒性出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD）又称兔瘟，是由兔出血性病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染所致的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病，是危害养兔业的一种烈性、毁灭性传染病[12]。兔出血症病毒是RNA病毒，属于杯状病毒，是单股正链RNA病毒[3]。兔出血症病毒的基因组中衣壳蛋白VP60是RHDV唯一的结构蛋白，与诱导抗病毒感染的免疫反应有直接关联，是病毒免疫保护性抗原[46]。
兔多杀性巴氏杆菌病（Pasteurellosis）又称兔出血性败血症（Hemorrhagic septicaemia，HS）是由兔多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.m）引起的兔的急性传染病。家兔感染兔多杀性巴氏杆菌之后，由于感染部位不同而呈现不同的临床症状，主要的临床症状有败血症型、鼻炎型、肺炎型、中耳炎型、结膜炎型等[78]。
由于兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病都是兔常见的急性、烈性传染病，一旦暴发，会给养殖兔业带来巨大的经济损失[910]，但目前又没有有效的药物可以治疗，因此对以上两种病症的防控措施尤为重要。目前，预防兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病的发生主要靠注射灭活疫苗。
疫苗可诱导兔体产生免疫保护，其中起重要作用的是保护性抗体，因此需要一种方法用于检测兔体内保护性抗体的水平，进而判断兔的感染状况和疫苗保护程度。家兔 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
经疫苗免疫后，体内产生抗体，在一定程度上能反映疫苗的免疫效果。因此需要进行抗体检测，目前抗体检测方法有很多种，如间接血凝实验[1112]、琼脂凝胶扩散实验[1314]、酶联免疫吸附试验[1516]等。但由于间接血凝试验和琼脂凝胶扩散实验操作复杂，且敏感性低，受多种因素影响往往重复性不好，且这两种方法不适用于大量的临床血清样本进行快速检测。相较而言，ELISA具有操作简单、特异性好、稳定性强等的特点，因此广泛应用于抗体检测。本实验分别以重组的RHDV vp60蛋白、兔多杀性巴氏杆菌菌体破碎后的抗原液作为抗原，根据已建立的间接ELISA抗体检测方法[1718]对免疫后的血清样本进行检测，分析产生的抗体水平既疫苗的免疫效价。
1 实验材料
1.1 实验动物
35日龄家兔由邳州东方养殖有限公司、青岛康大兔业发展有限公司、金陵种兔场提供，2～3月龄家兔由金陵种兔场提供，SPF兔由邳州东方养殖有限公司提供。
1.2 主要试剂及仪器
兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BACVP60株）、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗（C5117株）及兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗（BACVP60株+C5117株）均由江苏省农业科学院兽医研究所制备、保存；脱脂乳购于光明乳业股份有限公司； TMB（显色液）购于湖州英创生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
不同量程的移液枪（1mL、200μL、100μL、10μL、2.5μL）、300μL排枪等购于自德国Eppendorf 公司；生化培养箱购于上海新苗医疗器械制造有限公司；酶标仪购自美国伯腾仪器有限责任公司；普通96 孔酶标反应板购自南京赛研生物技术有限责任公司。
2 实验方法
2.1 实验试剂的制备
（1）包被液（0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液）使用前高压灭菌
称取0.16g Na2CO3、0.3g NaHCO3 溶于100ml ddH2O 并调节pH至9.6。
（2）0.01mol/L pH7.4 磷酸盐NaCl缓冲液（PBS），使用前高压灭菌
称取8g NaCl、3.58g NaHPO412H2O、0.2g KCl、0.245g KH2PO4溶于1L ddH2O并调节pH 至7.4。
（3）PBST
在PBS使用前加0.05%Tween20 500μL。
（4）封闭液（5%脱脂乳）
称取5g脱脂乳用PBST定容至100ml，4℃储存，使用前需重新溶解，常温使用。
（5）终止液（2mol/L H2SO4）
吸取11ml H2SO4加入89ml ddH2O中。
2.2 不同兔场家兔进行分组免疫
在邳州东方养殖有限公司（简称东方）、青岛康大兔业发展有限公司（简称康大）、金陵种兔场（简称金陵）三个兔场进行三批次的兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗（BACVP60株+C5117株）免疫期试验；在每个兔场用不同批次的二联苗，分别在35日龄家兔颈部皮下注射二联苗1ml、2ml，连同对照组，在免疫前及免疫后每隔1个月采血，分离血清，做好标记，20℃保存。
2.2.1 兔临床血清样本的采集和处理
采用心脏采血方法，将采集到的血液放入37℃温箱1h，然后再放入4℃冰箱1h，5000rpm离心5min，将上层血清转移到新的EP管中，定量分装并记录相应的标号，20℃冰箱保存待检。

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