根据厌氧真菌基因组内纤维素酶基因信息，选择两个代表性纤维素酶基因A05590和A16802，在线预测其分子量及特性，预测结果显示A05590目的蛋白分子量约为46.4kD，等电点为5.1；A16802目的蛋白分子量预测为84.3kD，等电点为4.85。将目的基因克隆至表达载体pET28α，构建成重组质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，成功构建了纤维素酶重组工程菌。用IPTG诱导目的蛋白表达后，测定重组纤维素酶的比酶活并对其酶学性质进行研究。结果显示，A05590的比酶活为0.013U/mg，A16802的比酶活为0.014U/mg。A05590最适反应温度为60℃，最适反应pH为6；A16802最适反应温度为50℃，最适反应pH为5。该研究为后续研究开发高效率、低成本的实用纤维素酶奠定了基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.1.1 菌株、载体质粒与主要试剂3
1.1.2 主要溶液配制3
1.2 方法4
1.2.1 目的蛋白理化性质及结构的预测4
1.2.2 重组质粒的构建4
1.2.3 表达载体酶切鉴定4
1.2.4 重组质粒的原核表达4
1.2.5 目的蛋白SDSPAGE鉴定5
1.2.6 纤维素酶比酶活测定5
1.2.7 酶学性质测定6
1.3 数据分析6
2 结果与分析6
2.1 目的蛋白理化性质及结构的预测6
2.2 表达载体的酶切鉴定7
2.3 目的蛋白SDSPAGE鉴定8
2.4 纤维素酶比酶活测定8
2.4.1 绘制葡萄糖标准曲线8
2.4.2 纤维素酶的酶活9
2.4.3 纤维素酶比酶活9
2.5 纤维素酶的最适温度9
2.6纤维素酶的最适pH9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
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大肠杆菌中的表达及酶学性质分析
指导教授 成艳芬
引言
引言 纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的有机物质之一，是由葡萄糖通过β1,4葡萄糖苷键聚合而成。近年来，纤维素作为地球上主要的可再生能源和生产生物乙醇的原材料而引起全世界的关注，除此之外，木质纤维素的半纤维素和寡糖可作为化学薄膜、保护胶体和动物饲料等。尽管纤维素在自然界中的含量丰富，但由于纤维素分子内和分子间氢键的存在使得分子链聚集在一起，形成结晶的原纤结构，而难以被非纤维素酶降解[1]。
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是一种由许多高协同作用的水解酶组成的复合酶体系，它能水解纤维素β1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖。在自然界中，纤维素的降解是通过由三种主要的纤维素酶组成的协同系统实现的，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶等[2]。纤维素酶对纤维素的降解利用对于解决目前我们所面临的能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有十分重要的意义。但是目前纤维素酶的生产存在发酵成本高、容易出现杂菌、产品质量不稳定并且长期以来缺乏高效菌株等问题，制约了纤维素酶的大规模生产应用[3, 4]。
近年来，随着分子生物技术的发展和利用，基因克隆表达为大量生产纤维素酶、实现纤维素酶的工业化应用提供了新的思路，且目前已取得了较大的进展[5]。
纤维素酶基因的克隆始于上世纪70年代末，1982年Whittle等首次报道纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的纤维素酶基因被克隆以来，纤维素酶系被人们不断地从细菌与真菌中发现和分离，大量纤维素酶的基因得到克隆和表达，极大地丰富了纤维素酶的研究材料[6]。到目前为止，已经有数千个纤维素酶基因序列和相应的氨基酸序列被报道和公布，这些数据均公布在GenBank、EMBL和DDBL等共享数据库中[7]。人们利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到大肠杆菌、真菌和家蚕生物反应器等各种表达系统中，以期得到新的比活力高的重组纤维素酶，并且，几乎所有克隆得的纤维素酶基因都成功在大肠杆菌或者其他宿主上实现了表达[7]。
反刍动物瘤胃中栖息着大量的厌氧真菌，这些厌氧真菌可以分泌高活性的纤维素酶，活性甚至优于工业用菌株[5]。因此，瘤胃厌氧真菌有望为纤维素酶生产提供高效菌株，但是由于厌氧真菌纤维素酶的产量有限，且目前瘤胃厌氧发酵技术也不完善，从而影响了瘤胃厌氧真菌纤维素酶的大规模工业化应用。因此，以瘤胃厌氧真菌纤维素酶为高效菌株来源，通过基因工程将纤维素酶基因进行外源表达，有望构建成高效降解纤维素的纤维素酶重组工程菌，从而提高纤维素酶的产量、降低生产成本，这对实现纤维素酶的大规模生产和应用有着重要意义。
本研究从厌氧真菌基因组中筛选了两个代表性纤维素酶基因，在线预测其特性，并将其克隆表达至大肠杆菌原核表达系统中，进行酶学性质分析，为该酶的后续研究工作奠定基础，并为研究开发高效率、低成本的实用纤维素酶提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、载体质粒与主要试剂
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）感受态细胞、克隆载体pUC57、表达载体pET28α，均来自上海生物工程有限公司。
胰蛋白胨（碧云天，ST800）、酵母提取物（碧云天，ST968）、SDSPAGE凝胶快速配制试剂盒（碧云天，P0012AC）、质粒小量提取试剂盒（碧云天，D0007S）、IPTG（碧云天，ST097）、卡那霉素（碧云天，ST101）、氨苄青霉素钠（碧云天，ST007）、1M TrisHCl，pH8.0（碧云天，ST780）、蛋白分子量标准（碧云天，P0060S）、Bradford蛋白定量试剂盒（Solarbio，PC0010）、限制性内切酶（Ndel/Xhol）购自上海生物工程公司

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