和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）是引起鸡球虫病的常见球虫种之一，一般在自然条件下会与其他球虫混合感染，从而加剧球虫的致病性。为预防鸡感染和缓艾美耳球虫，防止球虫病大规模爆发，同时为研发新型抗球虫疫苗打下基础，本实验选取和缓艾美耳球虫的重组Prx蛋白、重组1A蛋白、重组ADF蛋白这三种重组蛋白及以PLGA为载体的三种重组蛋白微粒对雏鸡进行免疫，之后以完全孢子化的和缓艾美耳球虫卵囊对每羽鸡进行攻虫，根据鸡的平均体重增加和排出卵囊总数的变化情况来评价其保护效果，结果表明重组Prx蛋白、重组1A蛋白、重组ADF蛋白及其以PLGA纳米颗粒为载体的三种重组蛋白对和缓艾美耳球虫都具有一定的免疫保护作用，且均能诱导鸡产生细胞免疫和体液免疫反应。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验动物2
1.1.2 和缓艾美耳球虫孢子化卵囊2
1.1.3 实验试剂的制备2
1.1.4实验仪器设备3
1.2 三种重组蛋白的表达和纯化3
1.2.1 确定最佳诱导时间 3
1.2.2 蛋白的大量表达 3
1.2.3 菌液的处理 3
1.2.4 纯化蛋白 3
1.3 PLGA纳米材料的制备4
1.4和缓艾美耳球虫孢子化卵囊的扩增与收集4
1.5三种重组蛋白的免疫保护性实验4
1.5.1实验动物及分组4
1.5.2实验过程4
1.5.3重组蛋白免疫效果评价指标5
2结果与分析5
2.1三种重组蛋白对鸡增重的影响5
2.2三种重组蛋白对球虫卵囊产量的影响 6
3 讨论6
致谢7
参考文献7
表1 三种重组蛋白对增重的影响5
表2 三种重组蛋白对球虫卵囊产量的影响6
和缓艾美耳球虫三种重组蛋白的免疫保护性研究
引言
鸡球虫病是一种对养禽业造成严重危 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
害的寄生虫疾病，主要由艾美耳属的肠道寄生原虫引起。目前世界公认的有7种艾美耳球虫[1]，其中和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）在我国有十五个省、市发现了这种球虫，虽然其在鸡常见球虫病中致病性相对较弱，但在自然条件下，和缓艾美耳球虫会和其他球虫种混合感染，从而使球虫感染症状加剧 [2]。一般当鸡感染低剂量的和缓艾美耳球虫时，不会出现肉眼可见的病理性变化 [3]。但高剂量感染时，就会出现不同程度的腹泻、体重下降以及采食量下降、产蛋量减少、喙部角质鳞片区黄色素减少、肠表面苍白,小肠肠壁变薄、肠内容物稀薄等病变[4]，同时，和缓艾美耳球虫会对鸡的增重产生影响，从而造成饲料转化率降低 [35]。
目前药物控制鸡球虫病仍然是一种主流的传统方式，但是随着抗球虫药的药物残留和耐药菌的问题逐渐显露出来，有研究者采用证实了球虫耐药性普遍存在[6]。虽然轮流用药和穿梭用药等方法来避免耐药性[7]，但在家禽产品中的药物残留会危害人类健康。鸡球虫病的预防势必以疫苗控制为研究方向。近年来球虫疫苗的研发主要集中在基因工程层面[810]。研究发现寄生虫的表面抗原及各种各样的亚细胞器抗原，以及球虫入侵机体的相关蛋白能够激活宿主细胞免疫和体液免疫，从而为新型疫苗的研发提供了基础[1112]。
本实验以重组ADF蛋白、重组1A蛋白、重组Prx蛋白和以PLGA为载体的这三种重组蛋白的纳米颗粒进行免疫保护性试验，探究其作为新型重组DNA疫苗的可能性，为和缓艾美耳球虫的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
本实验所用雏鸡均购自南通某鸡场，孵出后运回江苏省农业科学院实验动物中心饲养，饲喂不含任何抗球虫药的全价饲料。饲喂至两周龄，将雏鸡运回大学动物试验中心。动物实验开始前，采用常规方法镜检雏鸡有无球虫感染，确认无球虫卵囊污染后，即可用于动物实验。
1.1.2 和缓艾美耳球虫孢子化卵囊
用和缓艾美耳球虫孢子化卵囊，经过嗉囊接种的方式感染雏鸡(1.0 ×105 /羽)，收集第57d的粪便中的球虫卵囊,对卵囊进行孢子化，冰箱保存备用。
1.1.3 实验试剂的制备
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：取2.5g Amp加入20 mL去离子水，溶解摇匀，定容至25 mL，用 0.22 µm滤器过滤杂质，分装至2mL EP管中，封口膜封口，放入20 ℃保存。
卡纳霉素（Kanamycin，Kan）：取2.5g Kan加入20 mL去离子水，溶解摇匀，定容至25 mL，用 0.22 µm滤器过滤杂质，分装至2mL EP管中，封口膜封口，放入20 ℃保存。
LuriaBertani液体培养基：5g 酵母粉，10g NaCl固体 ，10g 胰蛋白胨，加入去离子水1000mL，充分搅拌溶解，装入1L锥形瓶中，常规高压灭菌后，4 ℃保存。
PBS：8g NaCl固体，0.2g KCl固体，1.42g Na2HPO4，0.27g KH2PO4，加入去离子水800mL，充分搅拌溶解，定容至1L，室温保存。
IPTG贮存液：6g IPTG，加入40mL去离子水，充分混匀，定容至50mL，0.22μm滤器过滤，封口膜密封，20℃保存。
上清Binding Buffer（20mM咪唑）：用29.2g NaCl固体，1.36g咪唑，加入100mL 无K+PBS混合，去离子水定容至1L，真空抽滤，常温保存。
上清Elution Buffer（500mM咪唑）：用14.6g NaCl固体，17g咪唑，加入50mL 无K+PBS混合，加入200mL去离子水，充分溶解，之后定容至500mL，真空抽滤，常温保存。
包涵体Binding Buffer（20mM咪唑）：29.2g NaCl固体，480g尿素，1.36g咪唑，加入100mL 无K+PBS混合，去离子水定容至1L，真空抽滤，常温保存。

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