目的 探究堆型艾美耳球虫（E. acervulina）感染鸡后对肠上皮细胞Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）表达水平的影响。方法 将体重相近的3周龄的试验鸡按随机分为高剂量感染组、低剂量感染组和空白对照组，每组15只鸡。低剂量感染组每只鸡经口感染5 ×104个E. acervulina孢子化卵囊，高剂量感染组每只鸡经口感染1 ×105个E. acervulina 孢子化卵囊，空白对照组不感染卵囊，分别在感染早期（感染后2天和3天）和感染晚期（感染后7天），每组分别取5只鸡收集十二指肠肠上皮细胞，提取RNA，反转录进行荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测鸡Toll样受体（Chicken TLRs, ChTLRs）表达水平变化。 结果 在低剂量感染组（5×104/只）中，感染早期，感染组的肠上皮细胞TLR21表达水平显著高于空白对照组。至感染晚期时，TLR5表达水平高于空白对照组。在高剂量感染组（1 ×105/只）中，感染早期，感染组的肠上皮细胞TLR1LA、TLR4表达水平显著高于空白对照组而TLR3在早期显著低于空白对照组；但到了感染的晚期时，TLR1LA、TLR1LB、TLR2A、TLR4、TLR5、TLR15、TLR21表达水平显著低于空白对照组。 结论 不同剂量E. acervulina可以对ChTLRs造成不同的影响，低剂量感染刺激ChTLRs的表达，高剂量感染早期刺激ChTLRs的表达，感染晚期抑制ChTLRs的表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1(材料与方法2
1.1(材料 2
1.2(方法 3
1.2.1(引物设计3
1.2.2(球虫卵囊扩增3
1.2.3(肠上皮细胞的收集3
1.2.4(肠上皮细胞总RNA提取和cDNA的合成4
1.2.5(肠上皮细胞TLRs的qPCR检测4
1.2.6(数据处理4
2(结果与分析5
2.1(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR1LA mRNA表达水平5
2.2(试验鸡感染E. *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
acervulina后十二指肠TLR1LB mRNA表达水平5
2.3(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR2A mRNA表达水平6
2.4(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR3 mRNA表达水平7
2.5(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR4 mRNA表达水平7
2.6(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR5 mRNA表达水平8
2.7(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR7 mRNA表达水平9
2.8(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR15 mRNA表达水平9
2.9(试验鸡感染E. acervulina后十二指肠TLR21 mRNA表达水平10
3(讨论11
致谢12
参考文献12
堆型艾美耳球虫感染对鸡肠上皮细胞Toll样受体表达水平的影响
引言
鸡球虫病是鸡的重要疾病之一，是由艾美耳属的球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内而导致的寄生虫病，可破坏鸡肠道的完整性，使消化系统出现紊乱，严重可导致雏鸡的死亡，耐过鸡也会出现生长缓慢、发育不良的症状，平均每年在全球可造成超过30亿美元的经济损失，堆型艾美耳球虫（E. acervulina）是主要鸡球虫之一，主要侵害十二指肠，毒力中等，可对禽类饲养业造成巨大损失[13]。由于耐药性明显增加以及禽类制品药物残留等原因，抗球虫药物使用越来越受到限制。免疫预防无药物残留，不会产生耐药性，是一种替代药物预防球虫病的理想方法，目前商品化的球虫疫苗为活疫苗（强毒疫苗和弱毒疫苗），但活疫苗存在着生产成本高、难保存、产量有限、存在散毒风险和免疫效果不理想等缺点。新型疫苗（如核酸疫苗和亚单位疫苗）具有无残留、安全、方便保存、生产成本低、能诱导全面的免疫反应等优点，因此，越来越受到人们的青睐。新型疫苗的研制需要明确鸡球虫的免疫机理，从而选择更加有效的候选抗原[4]。目前，有关鸡球虫免疫机理的研究多集中在获得性免疫的研究，有关鸡球虫先天性免疫方面的研究较少。鸡球虫先天性免疫方面的研究不但有助于阐明鸡球虫的免疫机理，还为新型疫苗候选抗原的筛选提供参考。
先天性免疫主要通过模式识别受体对外来病原进行识别，从而激活机体的先天免疫反应，对入侵病原体进行杀灭。Toll样受体（Tolllike receptors, TLRs）是动物先天性免疫系统中关键的模式识别受体之一，同时也是获得性免疫启动的关键受体[5]，是研究球虫感染的免疫机理和防控的重要着手点。TLRs在免疫系统中起着重要的作用，先天性免疫中其被激活后可通过识别各种非自身物质成分（如细菌、病毒以及真菌等）的病原相关分子模式（PAMPs），继而激活下游信号通路，诱导身体产生炎性因子以及Ⅰ型干扰素等成分，从而激活较强的免疫防御功能，此外TLRs还可以介导获得性免疫的发生[6]。已知鸡Toll样受体（ChTLRs）为10种，分别是TLR1LA、TLR1LB、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21，单独的TLR只能识别单一种类的配体，但TLRs家族配合可以识别广泛的病原体，在先天性免疫和获得性免疫中都有重要作用[5]。目前未见有关堆型艾美耳球虫（E. acervulina）的TLRs表达方面的研究报道，所以研究E. acervulina感染后TLRs表达水平的变化可为球虫免疫机理方面的研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1材料
1. 1. 1 试验动物
1日龄普通级海兰白鸡，购自海安县双利孵禽场，饲养在严格消毒并且无球虫的动物房中，饮水为自来水，饲料中无抗球虫药的成分，自由采食和饮水。试验动物均经过大学试验动物福利与伦理委员会审核（编号：PTA2019002，PTA2019004）。
1. 1. 2 主要试剂
TRI Reagent 购自SIGMA Life Science；无水乙醇，自国药集团化学试剂有限公司购买；氯仿，自上海凌峰化学试剂有限公司购买；异丙醇，自上海申博化工有限公司购买；RPMI 1640培养基购自Life Technologies公司; 4 × gDNA wiper Mix、5 × HiScriptⅡ qRT SuperMix Ⅱ、RNase free 去离子水、2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix、50 × ROX Reference Dye2均购自诺唯赞生物公司。
1. 1. 3 仪器和设备
高压灭菌器、SWCJ2FD型双人单面净化工作台、GRP9050型隔水式恒温培养箱、Eppendeorf Centrifuge 5424 R 高速冷冻离心机、长沙湘智离心机仪器有限公司TD6低速离心机、TaKaRa PCR Thermal Cycler、7500 Real Time PCR System、超低温冰箱、Thermo Scientific NANODROP ONE、1000mL 玻璃瓶、500mL 玻璃瓶、50mL EP管、1.5mL RNase free EP管、PCR管、玻璃皿、40目筛网（高压灭菌）、200目筛网（高压灭菌）、剪刀镊子、12孔细胞培养皿、各种规格的移液枪、无RNase的枪头等。

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