山羊副流感病毒(Caprinepara influenza virus type 3，CPIV3)属于副粘病毒科呼吸道病毒属，和牛副流感病毒3型(BPIV3)、人副流感病毒3型(HPIV3)为同一病毒属。其感染动物有着较高的发病率以及病死率，临床主要表现为呼吸道症状、腹泻、消瘦等症状。副粘病毒P基因除了可编码相应P蛋白外，因其碱基序列内普遍存在“AnGn”RNA编辑位点及overlapping编码特点，进而可能形成不同的编码产物，其中非结构蛋白C参与PIV3病毒的复制和装配过程，能够干扰宿主对病毒复制的抑制作用，而CPIV3是否编码非结构蛋白C尚不清楚。本研究通过载体构建、蛋白表达、抗体制备及Western Blot分析，确定CPIV3在病毒感染过程中可编码非结构蛋白C，为该蛋白后续的功能研究奠定了基础。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1样品 5
1.1.2试剂5
1.1.3仪器 6
1.2方法 6
1.2.1大肠杆菌传代培养6
1.2.2质粒提取6
1.2.3PCR扩增目的基因C6
1.2.4质粒与目的基因双酶切 7
1.2.5回收基因片段 7
1.2.6重组载体构建 7
1.2.7重组质粒导入工程菌DH5α 7
1.2.8重组质粒鉴定 7
1.2.9转化诱导表达菌 8
1.2.10最佳诱导时间的确定 8
1.2.11大量表达 8
1.2.12超声破碎大肠杆菌细胞 9
1.2.13过His镍柱纯化蛋白并做SDSPAGE电泳 9
1.2.14免疫小鼠 10
1.2.15眼球取血清分离多克隆抗体 10
1.2.16ELISA测定抗体效价 10
1.2.17病毒感染细胞蛋白的提取 10
1.2.18SDSPAGE电泳 11
1.2.19WesternBlot分析 1 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
1
2结果与分析12
2.1目的片段的获取12
2.2重组载体的构建与鉴定12
2.3蛋白的诱导表达最佳时间的确定13
2.4蛋白的纯化14
2.5多克隆抗体的制备14
2.6病毒编码蛋白C的鉴定14
3讨论 15
致谢16
参考文献17
山羊副流感病毒3型非结构蛋白C的鉴定
引言
山羊副流感病毒3型(Canine parainfluenza virus type3，CPIV3)是一种引起山羊出现严重呼吸道症状的病原，属于副黏病毒科的呼吸道病毒属，是一种有嚢膜的单股负链RNA病毒。CPIV3于2013年江苏省农科院兽医研究所在江苏南通山羊养殖场发现育肥山羊发病，采集病羊鼻拭子和血清分离得到[1]。山羊感染该病毒后会损害呼吸道上皮导致严重支气管肺炎[2]，且其发病率、死亡率都比较高，采用药物治疗的效果差[3]。序列进化和流行病学分析表明，CPIV 3与BPIV3和HPIV3的同源性较低[4]。有试验研究表明，山羊供毒后会导致喷嚏、鼻涕和眼分泌物增多、精神沉郁并且呼吸困难；但羊的体温、体增重无异常[5]。而且可以继发细菌和支原体的混合感染从而加剧病死率[6]。
为了明确CPIV3对易感动物的致病性,实验室利用CPIV3 分离株JS2013 采取滴鼻接种清洁级豚鼠, 通过血凝抑制试验、病理组织学和病理解剖学等一系列的实验以研究该病原对豚鼠的致病性。实验结果表明, 攻毒后2 天豚鼠开始打喷嚏、流鼻涕、眼分泌物增多并出现腹式呼吸，并且致死率高[7]。HI试验结果为豚鼠感染后5天开始出现血凝抑制抗体,持续升高至21 d [8]，该病的发生与流行给我国养羊业都造成了较大的经济损失，影响了养羊业的健康发展。
CPIV3 JS2013株基因组全长较长，为15618nt，病毒基因组组成与其他副黏病毒科成员基本一致。编码区占总基因组的93%，由病毒基因组的6个基因按照以下顺序排列组成：3leaderNPP MFHNLtrailer5。N基因位于基因组3末端，编码核衣壳蛋白；P基因编码含有627个氨基酸的P蛋白（磷蛋白）；M基因编码M蛋白（基质蛋白）；F基因编码F蛋白（融合蛋白）；HN基因编码HN蛋白（血凝素神经氨酸酶）；L基因编码含有2235个氨基酸的L蛋白（大分子结构蛋白）。
其中，P基因除了可编码相应P蛋白外，因其碱基序列内普遍存在“AnGn”RNA编辑位点及overlapping编码特点，进而可能形成不同的编码产物[9, 10, 11]。通过在“AnGn” RNA编辑位点处插入1个或2个碱基“G”，即可编码形成非结构蛋白V或D（W），目前呼吸道病毒属成员，除了HPIV1外均可编码非结构蛋白V(9, 10)。同时，通过自+11位置的起始密码子处overlapping编码，可形成非结构蛋白C，而不同病毒形成非结构蛋白C的种类和形式存在一定差异[9]。
已有研究证实，副黏病毒非结构蛋白C在病毒包装、复制、致病性及先天免疫应答等过程中均发挥重要作用[9, 10]，而CPIV3是否表达非结构蛋白C仍不清楚。本研究拟在前期研究基础上，原核表达非结构蛋白C，制备效价较高的多克隆抗体，进而用Western Blot鉴定病毒是否表达非结构蛋白C，为后续验证非结构蛋白C的功能特性奠定基础。
1.材料
1.1样品
工程菌DH5α及Rosetta（DE3）、目的基因CPIV3非结构蛋白C保存质粒（PMD18TC）。
1.1.2试剂
质粒提取试剂盒、佐剂、核酸胶、蛋白胶（分离胶、浓缩胶）、核酸及蛋白marker、上游引物、下游引物、PCR Mix、限制性核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、胶回收试剂盒、LB培养基、SDSPAGE试剂、0.01M PBS、膜染色液、显色液、PBST、TBST、转膜缓冲液等。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562241.html