猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是威胁全世界养猪行业的重要急性病毒性传染病，主要是以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病为临诊症状，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。宿主细胞microRNA（miRNA）能有效调控靶基因转录后的表达，研究发现其不仅能调节机体先天性免疫应答，而且在宿主和病毒的互作中扮演者重要调控角色。PRRSV感染可改变宿主细胞miRNA的表达谱，有些表达量明显变化的miRNA与PRRSV的复制通路相关。为了能有效筛选出抑制PRRSV复制的宿主细胞miRNA，本研究人工合成了10条候选miRNA的模拟物（包括阴性对照），通过体外过表达转染技术将miRNA转入PAM、Marc-145细胞，然后接种病毒，最后从病毒学、基因组复制和蛋白翻译水平来筛选出具有抑制PRRSV复制的miRNA。试验结果显示，只有miR-9具有明显抑制PRRSV复制的效果且抑制能力与miR-9的转染剂量呈正相关；不同接毒剂量的miR-9均能抑制PRRSV的复制；此外，miR-9能在不同基因型、不同毒力的PRRSV上能验证其抑制效果。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1材料与方法7
1.1材料7
1.1.1细胞与病毒7
1.1.2 miRNA模拟物8
1.1.3主要试剂8
1.1.4主要仪器9
1.2方法9
1.2.1细胞复苏及传代培养9
1.2.2 miRNA模拟物转染和细胞接毒10
1.2.3细胞活性检测10
1.2.4病毒生长曲线（TCID50）11
1.2.5 RNA分离提取、反转录和实时荧光定量PCR（qRTPCR）11
1.2.6间接免疫荧光试验（IFA）12
1.2.7SDSPAGE和Western Blotting12
2 结果与分析13
2.1 miR9具有抑制PRRSV复制的作用13
2.2转染不同剂量的miR9检测细胞凋亡情况18
2.3 miR9对PRRSV的抑制作用与剂量呈 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
正相关18
2.4 不同接毒剂量下miR9对PRRSV均有抑制作用20
2.5 miR9对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用20
3讨论21
致谢22
参考文献23
抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的宿主差异microRNA的筛选
引言
引言
1 PRRSV的研究概述
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus, PRRSV）长期以来是猪传染病界中的“关注焦点”，其稍有变化或许就会掀起新一轮的疫病风暴。该病毒引起的疾病称为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS），给全球养猪业带来了严重的影响，该病主要以母猪生产障碍、仔猪呼吸困难以及持续性感染为临诊症状[1]。PRRSV在1987年以前是完全未知的，直至1987年在美国中西部、1990年在欧洲陆续被研究人员报道出来，此后经过迅速传播，现今已在大多数国家广泛流行该病[2]。1995年，我国某猪场爆发了重大疫病；1996年，相关研究人员从病猪中分离到此病毒[3]；2006年，在我国江西、江苏等省份爆发了猪的“无名高热”病，临床症状为体温升高（可达42°C）、耳朵发绀、传播迅速、高发病率、高死亡率以及各种年龄段的猪均可发病，后来被确认是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic PRRSV, HPPRRSV），较之经典毒株，其在非结构蛋白2（NonStructure Protein 2, NSP2）上有30个氨基酸的不连续性缺失[4]。
PRRSV是套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员[5]，其基因组为有囊膜不分节段的单链正义RNA，长度大小约15 kb，中间为编码区（Coding Sequence, CDS），5’端为帽子（Cap）结构和非编码区（5’Untranslated Region, 5’UTR），3’端为poly(A)尾结构和非编码区（3’Untranslated Region,3’UTR）[6]，至少囊括了10个开放阅读框（Open Reading Frame,ORFs）。ORF1a 和ORF1b为非结构蛋白编码区，约占整个基因组长度的3/4，其可编码出pp1a、pp1b复制酶，再通过蛋白酶分解为至少15个非结构蛋白（NonStructure Proteins, NSPs），参与形成多聚复制转录酶复合体（RTC），从而启动病毒基因组复制和亚基因组转录[7]。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7为结构蛋白编码区，约占整个基因组长度的1/4，分别编码GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、膜蛋白M和核衣壳蛋白N[5,811]。
PRRSV主要分为欧洲型（基因1型）和北美型（基因2型），代表毒株分别为Lelystad株[12]和VR2332[13]，尽管引起的临床症状相似，但两者的基因组序列仅有60 %左右的相似性[14,15]。PRRSV最初是从猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage, PAM）中分离得到的[16]，到目前为止，由于其受限于对宿主细胞上特定受体的需求，PRRSV的易感宿主细胞库有限，体内细胞包括PAM和猪血液单核细胞，传代细胞包括非洲绿猴肾细胞MA104的亚细胞系Marc145细胞[17]。PRRSV的感染需要合适的细胞受体表达，包括hepS、CD169、CD163、波形蛋白、CD151和DCSIGN[18]等以促进其吸附、进入、脱壳、释放并辅助其在细胞内复制[19]。
目前，虽然对PRRSV的理论基础和试验研究较深入，也有不少防控该病的疫苗已推广入市场，但由于PRRSV基因组突变较快，不断有新的突变株出现，研发速度跟不上病毒变异，可造成持续性感染和免疫抑制，引发的临床症状亦愈加复杂，导致疫苗治疗效果不佳。因此，从影响宿主和病毒互作的机制着手，寻找潜在的广谱安全高效的药物来防控该病依旧十分有必要。

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