新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病。由于近年来疫苗免疫的不理想，让人们从过去对HN和F基因的热衷研究，开始转向其他基因及突变分析的研究中去。本实验对新城疫病毒的磷蛋白（Phosphate Protein P）基因片段进行克隆，将P基因重组进带His标签的pCold I表达载体中，之后分别转化入克隆宿主菌E.coli DH5α和表达宿主菌E.coli BL21中。对重组转化均成功的BL21工程菌进行原核表达及鉴定，之后大规模诱导表达并纯化产物。本实验成功克隆了NDV的P基因，并实现了其在原核表达系统中的高效表达，为以后的新城疫病毒疫苗、新型诊断试剂的研制等奠定基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 主要材料 4
1.2 主要仪器 4
1.3 目的基因片段的扩增4
1.3.1 病毒的扩繁4
1.3.2 病毒总RNA的抽提4
1.3.3 RTPCR扩增P基因5
1.4 原核表达载体的构建与验证 5
1.4.1 感受态细胞的制备5
1.4.2 空载质粒的扩增5
1.4.3 重组质粒pColdINDVP的构建5
1.4.4 重组质粒的转化6
1.4.5 菌液PCR鉴定6
1.5 P基因的原核表达及鉴定6
1.5.1 重组蛋白的诱导表达6
1.5.2 重组蛋白的可溶性分析6
1.5.3 重组蛋白的SDSPAGE鉴定6
1.5.4 考马斯亮蓝染色7
1.5.5 Western blot7
1.6 蛋白的大量表达和纯化7
1.6.1 重组蛋白的大量表达7
1.6.2 蛋白的纯化7
2 实验结果8
2.1 目的基因片段的扩增8
2.2 重组质粒的鉴定8
2.3 测序结果8
2.4 重组蛋白诱导表达的鉴定9
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2.5 纯化重组蛋白的SDSPAGE鉴定9
2.6 纯化重组蛋白的Western blot分析9
3 讨论 10
3.1 蛋白质芯片10
3.2 疫苗研制10
3.3 NDVP基因功能的研究11
致谢12
参考文献12
附录13
新城疫病毒P基因的克隆及原核表达
引言
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒强毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病，俗称“亚洲鸡瘟”[1]。在我国，ND被农业部规定为一类动物疫病。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）为副粘病毒科禽腮腺炎病毒属中的一员，属于禽副粘病毒1型[2]。在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素—神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。尽管NDV存在多个基因型，但只有一个血清型。强毒株和弱毒株的主要差异是在F0蛋白的112117位氨基酸基序即裂解位点上。
P基因约1.4kb，编码395个氨基酸，分子量约为42KD，病毒粒子中含量较少[3]。它具有病毒特异性，目前为止研究的较少，其蛋白的确切作用尚未清楚。P基因除了可以转录翻译P蛋白外，还可以通过转录修饰表达另外两种蛋白，为V蛋白和W蛋白。研究表明，新城疫病毒在感染细胞的早起会编码出早起蛋白（NP、P蛋白），NP、P、L蛋白结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）后，开始其他翻译晚期蛋白F、HN及M蛋白等[4]。其中，P蛋白可以与前体NP蛋白作用，形成PNP复合体，阻止NP蛋白与病毒核酸的组装，此外，P蛋白还可以延长基因表达的能力。可见，P蛋白在病毒感染细胞初期有着重要作用。
本实验对新城疫病毒的磷蛋白（Phosphate Protein ，P蛋白）基因片段，进行引物设计和PCR扩增，并且重组进带His标签的pCold I表达载体中，之后分别转化入克隆宿主菌E.coli DH5α和表达宿主菌E.coli BL21中。然后，对菌液进行PCR鉴定，分析P基因是否成功连接在pCold I载体上及转化入了工程菌中。利用IPTG对表达表达宿主菌E.coli BL21进行诱导表达，收集并裂解细菌，对裂解上清液和裂解细菌沉淀及时分开并对重组蛋白的可溶性进行分。鉴定完NDVP蛋白的表达形式以后，扩大菌株的培养规模，对NDVP蛋白进行大量表达。利用镍离子琼脂糖珠与6个连续排列组氨酸（6xHis）标签的亲和作用，对表达产物进行蛋白纯化[5,6]。最后，对表达产物进行SDSPAGE和Western blot实验鉴定，分析产物大小是否与预期一致，以及重组蛋白是否与鸡新城疫的阳性血清具有良好的免疫反应性。
过去，对NDV的F和HN基因研究较多，以及针对这两个蛋白的单抗也被广泛研究。然而近年来出现了越来越多的疫苗免疫失败，以及血清抗体高浓度时，仍有被感染排毒的反常现象，让人们开始关注并研究NDV的其他基因。其中P基因，经研究发现，其与NDV早期感染细胞起到重要作用，以及对基因的表达也有正向作用。然而这些研究多为初步探索，其确切的生物学作用仍不清楚。本实验对NDVP基因的克隆及原核表达进行构建，并摸索了诱导表达的最佳条件，为NDVP基因的研究，做前期准备及初步探索，以及为临床应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
表达载体为pCold I、克隆宿主菌为E.coli DH5α、表达宿主菌为E.coli BL21以及 NDVLaSota 疫苗毒株均由本实验室保存。Trizol购自上海普飞生物技术有限公司；反转录试剂盒购自南京诺唯赞公司；限制性内切酶Sac I、Hind III购自Takara公司；凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司；Ni填料购自QIAGEN公司；羊抗鼠IgGHRP标记二抗，KPL公司。

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